西瓜枯萎病菌FoCdk7、FoCdk9、FoCdk10和FoNot2基因在致病性中的功能研究

发布时间：2017-10-03 01:17

  本文关键词：西瓜枯萎病菌FoCdk7、FoCdk9、FoCdk10和FoNot2基因在致病性中的功能研究

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【摘要】：由尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)侵染引起的西瓜枯萎病,是西瓜上的一种重要真菌病害,严重威胁着我国西瓜产业的发展,但有关西瓜枯萎病菌致病性机制的研究相对有限。本文重点研究了西瓜枯萎病菌中细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent Kinases,CDKs)家族中FoCdk7、 FoCdk9和FoCdk10以及CCR4-NOT(Carbon catabolite repressor 4,negative on TATA-less)复合体中FoNot2在致病性中的功能及其可能的作用机制。本文主要依靠基因敲除技术,鉴定到了西瓜枯萎病菌中3个CDKs家族基因FoCdk7、FoCdk9、FoCdk10和1个CCR4-NOT复合体基因FoNo52;成功获得其缺失突变体和回补突变体；通过表型分析、致病性测定、胁迫压力测定和毒素测定等方面研究,系统地分析了这4个基因的生物学功能。主要研究结果如下：(1)通过测定菌落形态、产孢量、分生孢子萌发率和致病性等表型,发现FoCdk7、FoCdk9、FoCdk10和FoNot2基因均调控了西瓜枯萎病菌的气生菌丝生长、色素合成、产孢量和致病性,并显著影响了西瓜枯萎病菌的穿透能力,可能是调控其致病性的首要原因。(2)通过突变体对细胞壁胁迫因子敏感性研究,发现FoCdk7、FoCdk9、 FoCdk10和FoNot2基因均可影响西瓜枯萎病菌细胞壁的完整性,6个几丁质合酶相关基因的表达也受到显著调控,表明FoCdk7、FoCdk9、FoCdk10和FoNot2基因直接或间接参与调控西瓜枯萎病菌的细胞壁完整性途径。(3)FoCdk7、FoCdk9、FoCdk10和FoNot2基因影响了西瓜枯萎病菌对氧化胁迫的反应,这些基因的缺失均减弱了对氧化胁迫因子的抗性,5个过氧化物酶合酶相关基因的表达也显著低于野生型,表明FoCdk7、FoCdk9、FoCdk10和FoNot2基因调控西瓜枯萎病菌的抗氧化胁迫能力。(4)通过HPLC技术分析菌株中FA毒素含量,发现△FoCdk7、△FoCdk9、ΔFoCdk10和ΔFoNot2突变体中的FA毒素合成量显著下降,6个FA合成相关基因的表达水平同时也显著下调,说明了FoCdk7、FoCdk9、FoCdk10和FoNot2基因调控西瓜枯萎病菌的FA毒素合成,可能是影响其致病性的关键因素。本研究结果表明,FoCdk7、FoCdk9、FoCdk10和FoNot2基因在西瓜枯萎病菌生长发育、环境适应性、致病性和毒素合成等生命过程中均发挥了重要作用。
【关键词】：西瓜枯萎病 西瓜枯萎病菌 致病性 CDKs CCR4-NOT FA
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S436.5
【目录】：

• 致谢5-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-14
• 第一章 文献综述及研究背景14-28
• 1.1 西瓜枯萎病菌致病机理研究进展14-18
• 1.1.1 西瓜枯萎病菌致病性的生理分化14
• 1.1.2 西瓜枯萎病菌的致病机理14-18
• 1.2细胞周期蛋白依赖性激酶及其功能18-21
• 1.2.1 CDKs的发现、分类及形态结构18-19
• 1.2.2 真核生物中CDKs的功能19-21
• 1.3 CCR4-NOT复合体及其功能21-25
• 1.3.1 CCR4-NOT复合体的组成和结构22-23
• 1.3.2 CCR4-NOT复合体的功能23-25
• 1.4 本研究的目的意义与主要内容25-28
• 1.4.1 研究的目的与意义25-26
• 1.4.2 研究的主要内容26-28
• 第二章 材料与方法28-42
• 2.1 实验材料28-30
• 2.1.1 菌株28
• 2.1.2 载体28
• 2.1.3 供试植物28
• 2.1.4 生化试剂28
• 2.1.5 供试抗生素28
• 2.1.6 供试培养基配方28-29
• 2.1.7 PCR引物(见附表)29-30
• 2.2 实验方法30-42
• 2.2.1 西瓜枯萎病菌的培养和保存30
• 2.2.2 西瓜枯萎病菌基因组DNA的提取30
• 2.2.3 PCR技术30-31
• 2.2.4 DNA电泳31
• 2.2.5 DNA克隆与载体构建31-32
• 2.2.6 西瓜枯萎病菌的敲除、回补载体构建与验证32
• 2.2.7 西瓜枯萎病菌的原生质体转化32-33
• 2.2.8 西瓜枯萎病菌转化子的Southern blot分析33-36
• 2.2.9 西瓜枯萎病菌RNA的提取36
• 2.2.10 cDNA的合成36-37
• 2.2.11 实时荧光定量PCR37
• 2.2.12 西瓜枯萎病菌的生物学特性分析37
• 2.2.13 西瓜枯萎病菌致病性实验37-38
• 2.2.14 西瓜枯萎病菌菌量测定38
• 2.2.15 西瓜枯萎病菌的扫描电镜观察38
• 2.2.16 西瓜枯萎病菌FA毒素含量测定38-39
• 2.2.17 西瓜枯萎病菌的胁迫压力测定39
• 2.2.18 西瓜枯萎病菌的几丁质含量检测39-40
• 2.2.19 西瓜枯萎病菌的过氧化物酶活性测定40-42
• 第三章 结果与分析42-82
• 3.1 西瓜枯萎病菌FoCdk7、FoCdk9和FoCdk10基因的功能分析42-64
• 3.1.1 FoCdk7、FoCdk9和FoCdk10基因的序列分析42-45
• 3.1.2 FoCdk7、FoCdk9和FoCdk10基因敲除与回补45-48
• 3.1.3 FoCdk7、FoCdk9和FoCdk10基因缺失突变体的菌落形态48-49
• 3.1.4 FoCdk7、FoCdk9和FoCdk10影响西瓜枯萎病菌产孢与分生孢子萌发49-51
• 3.1.5 FoCdk7、FoCdk9和FoCdk10基因参与调控西瓜枯萎病菌的致病51-53
• 3.1.6 FoCdk7、FoCdk9和FoCdk10基因影响西瓜枯萎病菌的侵染能力53-56
• 3.1.7 FoCdk7、FoCdk9和FoCdk10基因影响西瓜枯萎病菌的FA毒素合成56-58
• 3.1.8 FoCdk7、FoCdk9和FoCdk10基因影响西瓜枯萎病菌的细胞壁完整性58-61
• 3.1.9 FoCdk7、FoCdk9和FoCdk10基因影响西瓜枯萎病菌对氧化胁迫的敏感性61-64
• 3.2 西瓜枯萎病菌FoNot2基因的功能分析64-82
• 3.2.1 FoNot2基因的序列和表达模式分析64-66
• 3.2.2 FoNot2基因的敲除与回补66-67
• 3.2.3 FoNot2基因缺失突变体的菌落形态67-68
• 3.2.4 FoNot2基因对西瓜枯萎病菌产孢和形态分化的影响68-71
• 3.2.5 FoNot2基因调控了西瓜枯萎病菌的细胞壁完整性71-73
• 3.2.6 FoNot2基因对西瓜枯萎病菌致病性的影响73-75
• 3.2.7 FoNot2基因影响西瓜枯萎病菌的侵染能力75-77
• 3.2.8 FoNot2基因影响西瓜枯萎病菌的对氧化胁迫的敏感性77
• 3.2.9 FoNot2基因调控西瓜枯萎病菌FA毒素的合成77-82
• 第四章 全文小结82-84
• 第五章 讨论与展望84-88
• 5.1 讨论84-86
• 5.2 后续工作展望86-88
• 参考文献88-100
• 附录100-104

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本文编号：962339