猪流行性腹泻病毒G1与G2基因亚型毒株抗原差异性分析

发布时间：2017-10-03 04:28

  本文关键词：猪流行性腹泻病毒G1与G2基因亚型毒株抗原差异性分析

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【摘要】：猪流行性腹泻病毒(PEDV)是一种通过小肠感染,引起猪呕吐、腹泻、脱水的急性高度接触性传染病。2010年起在我国迅速爆发,对仔猪的致死率高达80%-100%。虽然弱毒疫苗与灭活疫苗对PEDV的流行起到一定的控制作用,但PEDV仍在我国广泛存在,对养猪业造成重大经济损失。PEDV可分为G1与G2基因亚型,两亚型间可诱导机体产生中和抗体的病毒纤突(Spike,S)蛋白氨基酸序列存在缺失、插入和大量点突变。为进一步研究S蛋白序列的变异是否造成病毒抗原性的差异,本课题选取PEDV G1亚型CV777疫苗株与G2亚型LNCT2流行株,对其S基因进行密码子优化,利用真核表达系统建立一种表达和纯化重组S蛋白的方法。重组S蛋白免疫小鼠血清中IgG抗体水平显著升高。用所制备抗S蛋白多克隆抗体(Polyclonal antibody,PAb)与不同亚型毒株进行间接酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)、Western blot、交叉中和试验(Serum neutralization,SN)分析抗原差异性。ELISA结果显示抗S蛋白PAb与同型S蛋白反应效价可达1:204800,与不同型S蛋白反应效价为1:102400。IFA结果表明抗S蛋白PAb针对同型毒株反应产生荧光时抗体最大稀释倍数为1:51200,针对不同型毒株反应产生荧光抗体最大稀释倍数为1:25600。SN结果为抗CV777 S蛋白PAb中和CV777毒株的平均效价为1:336,交叉中和LNCT2毒株的效价为1:150;抗LNCT2 S蛋白PAb中和LNCT2毒株的平均效价为1:387,而交叉中和CV777毒株的效价为1:230。结果表明不同亚型毒株间虽具有较强的交叉保护性,但PEDV S蛋白序列的变异使G1、G2亚型毒株产生了一定的抗原差异。为进一步探究G1与G2亚型S蛋白产生抗原性差异的关键区域,本课题筛选出5株S蛋白单克隆抗体(Monoclonal antibody,MAb),均可识别天然病毒中S蛋白。其中L5F7株MAb只与LNCT2毒株反应而不与CV777毒株反应,可用于鉴别G1与G2亚型毒株。利用截短表达蛋白方式初步鉴定其表位区位于S蛋白N端1-234位氨基酸(aa)之间,为构象表位。通过对S蛋白氨基酸序列比对后发现,G1与G2亚型S蛋白在S1区21-402aa间高度变异,应用杆状病毒表达系统表达CV777、LNCT2株S121-402aa蛋白并制备PAb,进行ELISA、IFA、SN等试验,结果表明S121-402aa PAb与不同型毒株的反应效价差异不显著,从而证明S121-402aa蛋白序列的高度变异并未产生明显的抗原性差异。本课题以PEDV S蛋白为研究重点,证实G1与G2基因亚型病毒在分子水平与抗原性上均发生变异,并初步分析产生抗原性变异的关键区域,为了解PEDV在我国的遗传变异情况,对现有疫苗的评价,新疫苗的筛选和研制提供理论依据。
【关键词】：猪流行性腹泻病毒 S蛋白 CV777 LNCT2 抗原性差异
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-13
• 第一章 引言13-20
• 1.1 猪流行性腹泻病毒概述13-15
• 1.1.1 PEDV的分类13
• 1.1.2 PEDV基因组与结构13-14
• 1.1.3 PEDV结构蛋白14-15
• 1.2 PEDV近十年(2006-2015)流行情况15-17
• 1.2.1 欧美流行情况15
• 1.2.2 亚洲流行情况15
• 1.2.3 中国流行情况15-16
• 1.2.4 我国PEDV遗传变异分析16-17
• 1.3 疫苗及研究进展17
• 1.4 PEDV S蛋白受体与抗原性研究进展17-19
• 1.4.1 PEDV受体研究进展17-18
• 1.4.2 PEDV S蛋白抗原性研究进展18-19
• 1.5 研究的目的和意义19-20
• 第二章 PEDV G1与G2亚型毒株S蛋白抗原差异性分析20-32
• 2.1 材料20-21
• 2.1.1 毒株、细胞、实验动物与质粒20
• 2.1.2 主要仪器与设备20
• 2.1.3 主要试剂与溶液20-21
• 2.2 方法21-25
• 2.2.1 CV777、LNCT2毒株S蛋白密码子优化21
• 2.2.2 优化S基因真核表达载体的构建21-23
• 2.2.3 重组CV777、LNCT2 S蛋白的表达23
• 2.2.4 重组CV777、LNCT2 S蛋白的纯化23-24
• 2.2.5 CV777、LNCT2 S蛋白多克隆抗体的制备24
• 2.2.6 免疫小鼠血清中IgG抗体的检测24
• 2.2.7 间接免疫荧光试验24
• 2.2.8 Western blot分析24
• 2.2.9 交叉中和试验24-25
• 2.3 结果25-30
• 2.3.1 CV777、LNCT2 S基因密码子优化25
• 2.3.2 重组真核表达载体的构建25
• 2.3.3 重组CV777、LNCT2 S蛋白的表达与纯化25-27
• 2.3.4 S蛋白免疫小鼠血清IgG抗体含量变化27-28
• 2.3.5 间接ELISA评价G1、G2亚型S蛋白间抗原差异性28
• 2.3.6 间接免疫荧光评价G1、G2亚型毒株抗原差异性28-29
• 2.3.7 Western blot评价G1、G2亚型毒株抗原差异性29-30
• 2.3.8 中和试验评价G1、G2亚型毒株抗原差异性30
• 2.4 讨论30-32
• 第三章 PEDV S蛋白单克隆抗体的制备及差异性抗原表位初步筛选32-40
• 3.1 材料32-33
• 3.1.1 毒株、细胞32
• 3.1.2 主要仪器与设备32
• 3.1.3 主要试剂与溶液32-33
• 3.2 方法33-35
• 3.2.1 CV777、LNCT2株S蛋白单克隆抗体的制备33-34
• 3.2.2 PEDV S蛋白单克隆抗体免疫活性的鉴定34-35
• 3.2.3 单克隆抗体亚型特异性检测35
• 3.2.4 LNCT2株病毒特异性单克隆抗体L5F7抗原表位初步鉴定35
• 3.3 结果35-39
• 3.3.1 单克隆抗体效价的测定35-36
• 3.3.2 单克隆抗体亚型鉴定36
• 3.3.3 单克隆抗体Western blot鉴定36
• 3.3.4 单克隆抗体IFA鉴定36-37
• 3.3.5 单克隆抗体中和活性的鉴定37
• 3.3.6 LNCT2特异性单克隆抗体的发现37-38
• 3.3.7 L5F7株MAb抗原表位的初步鉴定38-39
• 3.4 讨论39-40
• 第四章 PEDV G1与G2基因亚型S蛋白高变区抗原差异性分析40-50
• 4.1 材料40-41
• 4.1.1 毒株、细胞、质粒与实验动物40
• 4.1.2 主要仪器与设备40
• 4.1.3 主要试剂与溶液40-41
• 4.2 方法41-44
• 4.2.1 PEDV G1与G2亚型S蛋白高变区序列分析41
• 4.2.2 S61-1206bp基因重组载体的构建41-42
• 4.2.3 重组穿梭质粒Bacmid-CV777 S1，Bacmid-LNCT2 S1的制备与鉴定42-43
• 4.2.4 重组杆状病毒的拯救43
• 4.2.5 重组S121-402aa蛋白的表达、纯化与多克隆抗体的制备43
• 4.2.6 间接ELISA检测S1高变区抗原差异性43
• 4.2.7 IFA检测S1高变区抗原差异性43-44
• 4.2.8 中和试验检测S1高变区抗原差异性44
• 4.3 结果44-48
• 4.3.1 PEDV G1与G2亚型S蛋白高变区序列分析44
• 4.3.2 S61-1206bp基因的扩增与重组质粒的鉴定44-45
• 4.3.3 重组Bacmid与重组杆状病毒的鉴定45-46
• 4.3.4 重组PEDV S121-402aa蛋白表达与纯化46-47
• 4.3.5 间接ELISA评价G1、G2亚型S1高变区抗原差异性47-48
• 4.3.6 IFA、中和试验评价G1、G2亚型S1高变区抗原差异性48
• 4.4 讨论48-50
• 第五章 全文结论50-51
• 参考文献51-57
• 附录57-59
• 致谢59-60
• 作者简介60

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本文编号：963184