孕酮受体膜组分1基因在半滑舌鳎生殖功能的研究

发布时间：2017-10-04 15:38

  本文关键词：孕酮受体膜组分1基因在半滑舌鳎生殖功能的研究

  更多相关文章： 孕酮受体膜组分1 卵母细胞成熟 激素调控 基因敲降 表达分析

【摘要】：以半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)为研究对象,运用cDNA末端快速克隆技术、组织学切片、荧光实时定量(qRT-PCR)、RNA原位杂交、免疫组织化学、细胞培养技术、显微注射技术、Western-blotting等方法;获得了孕酮受体膜组分1(Progesterone receptor membrane component1,PGRMC1)的cDNA全长序列,对PGRMC1在性成熟雌鱼的组织表达及分布和在繁殖周期脑、垂体、卵巢中的表达特征进行了分析;对PGRMC1在不同发育时相的卵母细胞的表达特征进行了定量和定性研究;添加外源激素处理下,分析体外培养不同发育时相的卵母细胞中PGRMC1基因和蛋白的表达特征;对PGRMC1敲降与卵母细胞成熟关系进行分析;通过上述研究为探讨PGRMC1在半滑舌鳎生殖功能奠定基础,同时为提高鲆鲽类的人工繁殖技术提供了理论依据。研究结果如下:1.PGRMC1基因的克隆及组织和周期表达特征采用RACE方法,从半滑舌鳎卵巢中克隆了PGRMC1全长cDNA。半滑舌鳎PGRMC1基因全长为1335bp,其开放阅读框为546bp,编码了含181个氨基酸的蛋白;将推断的氨基酸序列与其他物种PGRMC1氨基酸序列进行多重比较分析,发现半滑舌鳎PGRMC1具有1个跨膜区域,在二级结构上与其他物种的PGRMC1具有很高的保守性;氨基酸序列与青溕(Oryzias latipes)同源性最高达到82.9%;与青斑河渶(Tetraodon nigroviridis)同源性为81.2%;系统进化分析显示半滑舌鳎PGRMC1与其他溕形目和渶形目鱼类聚为一个分支。qRT-PCR结果表明,PGRMC1 mRNA组织表达具有广泛性,但表达量存在差异,在卵巢组织中相对表达量最高(P0.05);半滑舌鳎垂体、脑和卵巢中PGRMC1 mRNA表达水平在不同卵巢发育时期的变化特性显示,卵巢中PGRMC1 mRNA表达水平在卵巢发育各个阶段都有较高表达水平(P0.05),垂体和脑中PGRMC1 mRNA在II到V期表达水平明显低于卵巢(P0.05);并且卵巢PGRMC1 mRNA表达水平在产卵期(V期)达峰值。2.半滑舌鳎PGRMC1在不同组织中基因和蛋白定位分析分析半滑舌鳎PGRMC1蛋白序列选择抗原表位,并合成相应的免疫多肽;将合成的多肽常规免疫新西兰大白兔,制备抗体。使用多克隆抗体进行Western-blotting检测蛋白的表达水平,多克隆抗体用合成的多肽封闭检测特异性。通过Western-blotting技术分析半滑舌鳎不同组织中PGRMC1的蛋白表达量情况。通过RNA原位杂交、免疫组化等方法分析舌鳎不同组织切片中PGRMC1mRNA和蛋白的分布情况。免疫印迹结果显示:PGRMC1蛋白在性腺、脑中表达量较高,在肾、头肾、垂体组织中也有表达,但表达量相对较低;说明PGRMC1主要在性腺、脑组织中发挥作用。RNA原位杂交结果显示:在卵巢成熟期中,PGRMC1 mRNA的阳性信号在卵母细胞的膜上分布明显,即PGRMC1在卵母细胞膜上显著性表达,进一步证明PGRMC1可能在膜/细胞质和细胞核内参与重要的细胞过程。在舌鳎肝脏、肾脏、头肾、脑、垂体也都检测到PGRMC1阳性信号,分布于组织的不同部位。PGRMC1在肝脏主要定位在胆小管和肝静脉等与外界联系的管腔周围,在肾脏中观察到其在肾小管附近表达丰富。从形态学上解析PGRMC1在不同组织中的表达特点,表明其在不同组织中能够介导孕激素行使不同生理作用。3.半滑舌鳎PGRMC1在不同发育时相卵母细胞中的表达量变化通过qRT-PCR和Western-blotting技术研究了性成熟半滑舌鳎PGRMC1mRNA在卵巢发育IV期和V期不同发育时相卵母细胞的表达,以及不同浓度HCG处理对卵巢发育V期鱼不同发育时相卵母细胞PGRMC1基因和蛋白的表达影响。结果显示:在不同发育期卵巢中,PGRMC1 mRNA的表达最高值出现在半滑舌鳎卵母细胞的不同发育时相,但整体趋势大体一致。在卵巢发育IV期,处于IV时相的卵母细胞PGRMC1 mRNA表达量最高(P0.05)。在卵巢发育V期,处于V时相卵母细胞PGRMC1 mRNA表达量最高(P0.05)。卵母细胞PGRMC1 mRNA表达的最高值出现在性腺发育V期,舌鳎的V时相卵母细胞,表明PGRMC1主要在成熟阶段发挥作用。采用不同浓度HCG处理卵巢发育V期舌鳎不同时相的卵母细胞,并对其表达量进行检测。结果显示:20IU/ml HCG对PGRMC1 mRNA和蛋白表达的调控作用比10IU/ml HCG作用更明显,表明PGRMC1 mRNA和蛋白表达对HCG调控作用存在剂量依存关系。并且HCG对舌鳎不同时相的卵母细胞的促成熟作用效果不同,在V时相促进作用最明显(P0.05),表明PGRMC1主要在成熟阶段发挥作用。HCG激素调控作用下,PGRMC1的正向应答效应预示其参与了卵母细胞成熟调控。4.半滑舌鳎PGRMC1敲降研究基因敲降技术是研究基因功能的一种重要的实验手段。本研究以体外培养的半滑舌鳎卵母细胞为实验材料,设计合成PGRMC1-Morpholino抑制半滑舌鳎PGRMC1基因的功能,同时设置对照组、注水组、反义组、反义对照组四个平行组,显微注射,然后运用qRT-PCR方法和Western-blotting方法检测显微注射后卵母细胞PGRMC1 mRNA和蛋白表达特征,研究PGRMC1表达下调对半滑舌鳎卵母细胞成熟过程的影响,为进一步探讨PGRMC1在半滑舌鳎繁殖过程的功能提供基础资料。
【关键词】：孕酮受体膜组分1 卵母细胞成熟 激素调控 基因敲降 表达分析
【学位授予单位】：大连海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 引言10-12
• 第一章 文献综述12-24
• 1. 硬骨鱼类下丘脑-垂体-性腺轴（HPG）调控研究12-14
• 2. 孕酮受体膜组分的研究进展14-22
• 2.1 孕酮受体膜组分的研究历程14-16
• 2.1.1 孕酮受体膜组分 114-16
• 2.1.2 孕酮受体膜组分 216
• 2.2 孕酮受体膜元件1的生物结构和生理学功能16-22
• 2.2.1 PGRMC1结构特征16-17
• 2.2.2 PGRMC1的生理学功能17-22
• 3. 本研究的目的与意义22-24
• 第二章 半滑舌鳎PGRMC1基因的克隆及组织和周期表达特征24-42
• 1. 材料25-26
• 1.1 实验材料25
• 1.2 相关试剂的配制25-26
• 2. 实验方法26-31
• 2.1 卵巢发育时期的确定26
• 2.2 总RNA的提取26-27
• 2.3 半滑舌鳎PGRMC1基因保守序列的克隆27-28
• 2.3.1 cDNA合成27-28
• 2.3.2 PGRMC1 cDNA保守序列的克隆28
• 2.4 PGRMC1基因cDNA全长克隆28-29
• 2.4.1 PGRMC1的 5’-RACE cDNA和 3’-RACE cDNA合成28
• 2.4.2 PGRMC1的 5’-RACE和 3’-RACE28-29
• 2.5 序列分析29
• 2.6 PGRMC1基因mRNA在性成熟雌鱼的组织表达特征29-31
• 2.6.1 PGRMC1引物设计29-30
• 2.6.2 PGRMC1 cDNA第一链合成30
• 2.6.3 PGRMC1标准曲线的制作30
• 2.6.4 PGRMC1 mRNA在性成熟雌鱼的组织表达特征30
• 2.6.5 数据处理30-31
• 2.7 半滑舌鳎PGRMC1 mRNA在繁殖周期脑、垂体、卵巢中的表达31
• 3 结果与分析31-38
• 3.1 半滑舌鳎繁殖周期卵巢组织学分析31-32
• 3.2 PGRMC1序列分析32-34
• 3.3 PGRMC1系统进化分析34
• 3.4 PGRMC1氨基酸序列比对及同源性分析34-36
• 3.5 PGRMC1基因mRNA在性成熟雌鱼的组织表达特征36
• 3.6 PGRMC1基因mRNA在繁殖周期脑、垂体、卵巢中的表达36-38
• 4. 讨论38-42
• 4.1 半滑舌鳎PGRMC1基因的生物信息学分析38-39
• 4.2 半滑舌鳎PGRMC1时空表达与生理功能分析39-42
• 第三章 半滑舌鳎PGRMC1的组织定位和分布42-64
• 1. 材料43-48
• 1.1 实验材料43
• 1.2 实验仪器43
• 1.3 试剂及耗材43-48
• 1.3.1 组织切片实验主要试剂44
• 1.3.2 原位试剂及其配制方法44-47
• 1.3.3 Western-blotting试剂47-48
• 1.3.4 免疫组化相关试剂48
• 2. 实验方法48-52
• 2.1 H.E染色石蜡切片48
• 2.2 PGRMC1／PBST-18质粒的构建48-49
• 2.3 地高辛标记PGRMC1正、反义RNA探针的合成和纯化49
• 2.4 切片原位杂交分析49-50
• 2.5 PGRMC1多克隆抗体制备及组织蛋白表达50-51
• 2.6 免疫组化51-52
• 2.7 统计分析52
• 3. 结果52-61
• 3.1 PGRMC1蛋白在组织的表达52-53
• 3.2 PGRMC1蛋白的细胞学定位53-57
• 3.3 PGRMC1基因的细胞学定位57-61
• 4. 讨论61-64
• 4.1 PGRMC1组织的表达与定位分析61-62
• 4.2 PGRMC1生理学作用分析62-64
• 第四章 卵母细胞PGRMC1的表达特征和敲降分析64-76
• 1. 实验材料与方法64-67
• 1.1 材料64-65
• 1.1.1 实验材料64-65
• 1.1.2 仪器和药品65
• 1.1.3 注射物的准备65
• 1.2 方法65-67
• 1.2.1 细胞培养65-66
• 1.2.2 卵母细胞的显微注射66
• 1.2.3 PGRMC1的实时荧光定量PCR检测66
• 1.2.4 PGRMC1的Western-blotting分析66-67
• 1.2.5 数据统计分析67
• 2. 结果67-73
• 2.1 PGRMC1在不同时相卵母细胞中的表达67-71
• 2.1.1 卵母细胞成熟过程中PGRMC1时序表达67-68
• 2.1.2 促性腺激素调控不同时相卵母细胞PGRMC1的表达68-71
• 2.2 孕激素诱导卵母细胞成熟71
• 2.3 卵母细胞PGRMC1显微注射分析71-72
• 2.4 基因敲降后卵母细胞PGRMC1的表达分析72-73
• 3. 讨论73-76
• 3.1 卵母细胞成熟过程PGRMC1的表达分析73-74
• 3.2 PGRMC1敲降对卵母细胞成熟的影响74-75
• 3.3 PGRMC1参与卵母细胞成熟的重要基因75-76
• 参考文献76-88
• 攻读硕士学位期间撰写的学术论文88-90
• 致谢90-94

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 李全海;十里海半滑舌鳎繁育成功[J];渔业致富指南;2005年21期

2 吕俊峰;半滑舌鳎繁育成功[J];中国农村小康科技;2003年03期

3 吕俊峰;海水养殖新品种——半滑舌鳎[J];农村百事通;2004年23期

4 ;养殖新品种—半滑舌鳎[J];天津水产;2005年04期

5 张守本;张志;任玉水;;半滑舌鳎的研究现状及发展前景[J];科学养鱼;2006年09期

6 徐勇;张修峰;曲克明;马绍赛;李健;宋德敬;;不同溶氧条件下亚硝酸盐和氨氮对半滑舌鳎的急性毒性效应[J];海洋水产研究;2006年05期

7 牛化欣;常杰;马u!;王莉;;半滑舌鳎生物学及养殖生态学研究进展[J];水产科学;2007年07期

8 李静;陈松林;邓思平;田永胜;沙珍霞;王清印;庄志猛;徐建勇;温海深;;半滑舌鳎雌性特异扩增片段长度多态性标记的筛选与应用[J];水产学报;2007年05期

9 孙业盈;张全启;齐洁;陈妍婕;李春梅;钟其旺;王志刚;;半滑舌鳎的一种细胞凋亡抑制因子的克隆、鉴定与分析[J];中国海洋大学学报(自然科学版);2008年06期

10 邓思平;陈松林;刘本伟;;半滑舌鳎FTZ-F1 cDNA克隆及表达分析(英文)[J];动物学研究;2008年06期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 陈松林;李静;邓思平;徐建勇;田永胜;沙珍霞;王清印;庄志猛;;半滑舌鳎性别相关分子标记和功能基因的克隆及其在性别控制中的应用[A];2007年中国水产学会学术年会暨水产微生态调控技术论坛论文摘要汇编[C];2007年

2 马骞;柳淑芳;庄志猛;唐启升;;半滑舌鳎生长激素及其受体基因的原核表达[A];中国海洋湖沼学会鱼类学分会、中国动物学会鱼类学分会2012年学术研讨会论文摘要汇编[C];2012年

3 陈松林;邓思平;田永胜;徐建勇;杨景峰;王清印;季相山;邓寒;翟介明;刘寿堂;;半滑舌鳎分子标记辅助性别控制技术的建立与应用[A];2007年中国水产学会学术年会暨水产微生态调控技术论坛论文摘要汇编[C];2007年

4 张正;李彬;王印庚;廖梅杰;王岚;荣小军;;养殖半滑舌鳎体表溃疡的组织病理学观察[A];中国水产学会鱼病专业委员会2013年学术研讨会论文摘要汇编[C];2013年

5 王旭波;张全启;齐洁;王志刚;王兴莲;;半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)W性染色体基因组的初步研究及其在育种上的应用[A];2008年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2008年

6 田永胜;陈松林;邵长伟;刘本伟;;鲈鱼冷冻精子在不同条件下诱导半滑舌鳎胚胎发育比较[A];2007年中国水产学会学术年会暨水产微生态调控技术论坛论文摘要汇编[C];2007年

7 李晋;史成银;耿伟光;王胜强;粟子丹;黄P";张庆利;;半滑舌鳎病毒性神经坏死病病原的研究[A];2013年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2013年

8 沙珍霞;章翔;丁少雄;陈松林;;半滑舌鳎鳗弧菌感染前后的免疫相关组织转录组分析[A];中国海洋湖沼学会鱼类学分会、中国动物学会鱼类学分会2012年学术研讨会论文摘要汇编[C];2012年

9 王旭波;张全启;庄伟;翟腾;王志刚;齐洁;王兴莲;;半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)雌鱼基因组研究[A];中国遗传学会第八次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编（2004-2008）[C];2008年

10 柳淑芳;马慧;马骞;庄志猛;;半滑舌鳎早期发育过程中骨骼发育及骨骼畸形[A];中国海洋湖沼学会鱼类学分会、中国动物学会鱼类学分会2012年学术研讨会论文摘要汇编[C];2012年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 特约通讯员 梁锦秋;中山成功培育半滑舌鳎苗[N];广东科技报;2006年

2 王玉峰;半滑舌鳎市场缺口大[N];中国渔业报;2004年

3 驻嵊泗记者 郑元丹　通讯员 胡园园 鲍后龙;枸杞人工试养半滑舌鳎[N];舟山日报;2011年

4 王玉峰;工厂化养殖半滑舌鳎[N];中国渔业报;2005年

5 黄海所;半滑舌鳎繁育生物学及产业化研究上台阶[N];中国渔业报;2007年

6 蒋怡;黄海所半滑舌鳎生物标记成为亮点[N];中国渔业报;2009年

7 孙德强;海阳半滑舌鳎苗种培育获进展[N];中国渔业报;2005年

8 记者 谭大跃　通讯员 王静思 郭中丹;半滑舌鳎全基因组测序完成[N];深圳特区报;2010年

9 姜英俊;促进半滑舌鳎生长的秘诀[N];中国渔业报;2011年

10 本报记者 郝玉玲;半滑舌鳎育苗可全人工调控[N];中国渔业报;2005年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 刘峰;半滑舌鳎经济性状的遗传评估及基因组选择初步研究[D];上海海洋大学;2015年

2 龙昊;半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）免疫相关基因HMGB2和IFIT1功能研究[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2015年

3 张正;养殖半滑舌鳎常见疾病的病理学观察与感染微生态分析[D];中国海洋大学;2012年

4 孙业盈;半滑舌鳎性腺差异表达基因的克隆鉴定与表达分析[D];中国海洋大学;2008年

5 郑媛;半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）细胞培养及细胞系建立研究[D];中国海洋大学;2012年

6 邵长伟;半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）性别决定的基因组学研究[D];中国海洋大学;2012年

7 吴莹莹;半滑舌鳎精子发生及其受精过程[D];中国海洋大学;2008年

8 庄志猛;半滑舌鳎早期发育生物学与种质资源研究[D];中国海洋大学;2006年

9 姜黎明;半滑舌鳎遗传连锁图谱的构建及染色体定位的初步研究[D];中国海洋大学;2013年

10 陈彩芳;四种细胞色素P450酶在半滑舌鳎繁殖生理机能中的作用研究[D];中国海洋大学;2010年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 赵敏;饲料中不同水平牛磺酸和磷虾粉对半滑舌鳎繁殖性能及后代质量的影响[D];上海海洋大学;2015年

2 邢贺飞;半滑舌鳎抗病相关SNP标记的筛选及两种免疫相关基因的克隆与初步分析[D];上海海洋大学;2015年

3 吴娅红;半滑舌鳎LGR8基因克隆和CSW3基因的功能验证[D];上海海洋大学;2015年

4 修旺珊;半滑舌鳎DKKL-1基因的克隆与表达分析[D];大连海洋大学;2015年

5 向晋松;半滑舌鳎补体调控因子I的鉴定、重组表达、功能分析及C3-1基因的初步研究[D];上海海洋大学;2015年

6 宋超;半滑舌鳎性别分化的遗传特性研究[D];甘肃农业大学;2015年

7 史学营;养殖半滑舌鳎无眼侧黑化机制的初步研究[D];上海海洋大学;2015年

8 刘田田;半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis）R-spondin1和R-spondin3基因的克隆与表达分析[D];中国海洋大学;2015年

9 杨芳;半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）R-spondin2基因的分子克隆、表达模式及其在肌肉发育过程中功能的初步探究[D];中国海洋大学;2015年

10 黄政举;半滑舌鳎IGF1和IGF2基因SNP与mRNA表达和生长性状的相关性研究[D];中国海洋大学;2015年

，

本文编号：971515