青霉素菌渣堆肥工艺及青霉素抗性基因的分布影响研究

发布时间：2017-10-05 09:18

  本文关键词：青霉素菌渣堆肥工艺及青霉素抗性基因的分布影响研究

  更多相关文章： 青霉素菌渣 好氧堆肥 β-内酰胺酶抗性基因 青霉素降解菌株

【摘要】：中国是抗生素的生产和使用大国,以青霉素为例,其生产和使用量在国内始终居于首位。青霉素生产过程中产生大量的菌渣,因其富含高蛋白,具有资源化回收或利用的可能,但菌渣中含有一定量的青霉素及其代谢产物,若处置不当,易引发抗生素抗性菌及抗性基因的诱导和富集,对环境和人类健康造成潜在威胁。本研究采用高温好氧堆肥工艺,将青霉素菌渣与猪粪混合堆肥处理,以期消除菌渣中的青霉素残留,实现菌渣的“变废为宝”,同时探讨青霉素菌渣堆肥过程中p-内酰胺酶基因型菌群的诱导富集效应,评价青霉素菌渣堆肥化处置的安全性。本研究以猪粪和青霉素菌渣为原料,以碎木屑为调节剂进行为期30d的高温好氧堆肥,整个堆制过程在江苏省南京市蔬菜科技园完成。堆肥过程中设置4个处理：处理1,猪粪：青霉素菌渣=1：1；处理2,猪粪：青霉素菌渣=2：1：处理3,猪粪：青霉素菌渣=4：1；对照组,纯猪粪。通过检测堆体的物理学、化学、生物学指标,对比分析不同青霉素菌渣添加比例对堆肥腐熟度的影响；基于实时荧光定量PCR (Real-time PCR)研究方法,对p-内酰胺酶A (bla_(-TEM)、bla_(-CTX-M-1)、 bla_(-CTX-M-9))、B (bla_(-IMP-1)、bla_(-VIM-2)、bla_(-NDM-1))、C(bla_(-CMY))、D(bla_(-OXA-23))四类基因进行绝对定量,初步探讨青霉素菌渣堆肥过程中β-内酰胺酶基因型菌群的演变过程；筛选青霉素降解菌,分析其降解特性,评价其成为青霉素菌渣堆肥菌剂的可行性。主要研究结论如下：经过30d的堆制过程,4个处理组物理学、化学和生物学指标均显示堆肥已腐熟,对比处理组和对照组堆肥理化参数发现,添加青霉素菌渣有助于延长堆肥的高温期。堆肥结束后,各处理的堆体温度接近室温,堆料颜色变为深褐色,堆体体积减小并变得松散,开始出现土腥味；pH值分别为7.3、7.4、7.3和7.9,EC值分别为6.3、5.5、5.3和4.3ms/cm;有机碳含量分别下降了14.1%、19.7%、17.7%和27.1%,总氮含量分别下降了27.4%、14.0%、4.4%和16.5%；发芽指数(GI)均超过80%,均达到了堆肥无植物毒性标准。高温好氧堆肥方式可以有效降解青霉素菌渣中的青霉素残留。运用超高效液相色谱(UPLC)法测定处理1、2、3的青霉素残留浓度,分别由初始的(305.1±16.8) mg/kg、(208.6±4.2)mg/kg和(74.9±3.0)mg/kg降至浓度低于UPLC方法检测限。各个处理的青霉素降解均符合一级反应动力学模型,处理1青霉素钠的降解速率常数(κ)为0.3d~(-1),降解半衰期(tl/2)为1.9d；处理2青霉素钠的k为0.2d-1,tl/2为2.4d；处理3青霉素钠的κ为0.2dq,t1/2为2.3d,与常温(25℃)下青霉素标准品的降解半衰期(39.4d)相比,堆肥化处理大大缩短了青霉素的降解时间。高温好氧堆肥过程对不同处理组的p-内酰胺酶不同基因型数量都有一定消减作用。堆肥结束(30d)后,4个处理中bla_(-TEM)基因数量与初始(0d)相比分别减少了69.4%、53.3%、67.9%和51.7%；bla_(-CTX-M-1)基因数量与初始相比分别减少了93.4%、98.8%、98.9%和84.6%；bla_(-CTX-M-9)基因数量与初始相比分别减少了99.0%、99.9%、99.9%和99.7%。bla_(-IMP-1)基因数量在处理1和处理2堆制结束分别增加至初始值的21.8和16.3倍,而处理3和对照组中bla_(-IMP-1基因数量与初始相比分别减少了99.8%和72.6%。处理1和处理3中bla_(-VIM-2)基因数量在堆肥结束后有所上升,分别增加为原来的0.7和4.0倍,处理2和对照组分别减少了99.8%和78.3%。bla_(-CMY)基因数量在处理1、2、3堆制过程中呈下降趋势,至堆肥结束分别减少了80.5%、43.6%和88.3%。堆肥结束后,处理1和处理2中已检测不到bla_(-OXA-23)基因,而处理3和对照组中该基因数量与初始相比分别减少了80.2%和74.3%。整个堆肥期间,各个处理样品中均未检测到bla_(-NDM-1)基因。通过平板划线法从处理组筛选出—株青霉素高效降解新菌,命名PC-2~T ,已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC1.15283)。经分子生物学鉴定,菌株PC-2~T 属螯合球菌属(Chelatococcus sp.)。经形态学及革兰氏染色观察,菌株PC-2~T 是革兰氏阴性菌,在LB固体培养基上菌落呈圆形,乳白色,表面光滑,中间有凸起,不透明,边缘整齐,直径约为1-2mm。在扫描电子显微镜下观察为短杆状,宽约为0.8～1.0μm,长约为1.8～2.81μm。主要脂肪酸为C18：1 w7c(50.7%)和C19:0 cyclo w8c(22.3%)。经HPLC法测得的G+C mo1%含量为70.9mo1%。当葡萄糖为碳源、蛋白胨为氮源、接种量为14%、pH为6-8时,菌株PC-2~T 在37℃下振荡培养6 h,对底物浓度为400 mg/L的青霉素钠的降解率达98%以上。青霉素菌渣堆肥产品各理化指标及生物学指标已达腐熟标准,能够用于农业生产。高温好氧堆肥过程对典型的几类p-内酰胺酶基因数量有一定的消减作用,但青霉素菌渣是否会诱导不同种类的抗生素抗性菌群,以及在病原微生物中的基因水平转移等科学问题还需进一步开展研究。
【关键词】：青霉素菌渣 好氧堆肥 β-内酰胺酶抗性基因 青霉素降解菌株
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X787;S141.4
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 绪论12-22
• 1.1 课题背景12-13
• 1.1.1 课题来源12
• 1.1.2 课题研究目的和意义12-13
• 1.2 国内外研究现状13-20
• 1.2.1 青霉素菌渣处理处置现状13-14
• 1.2.2 青霉素菌渣堆肥化处理处置现状14-17
• 1.2.3 抗生素抗性基因在堆肥过程中的富集、诱导研究进展17-20
• 1.2.4 微生物菌剂在堆肥中的应用20
• 1.3 主要研究内容20-21
• 1.4 研究技术路线21-22
• 第二章 青霉素菌渣与猪粪混合堆肥工艺研究22-32
• 2.1 实验材料、试剂和方法22-25
• 2.1.1 堆肥原料及理化性质22
• 2.1.2 主要实验试剂及仪器22-23
• 2.1.3 堆肥过程与样品采集23
• 2.1.4 主要理化指标及测定方法23-25
• 2.2 结果讨论25-30
• 2.2.1 堆体表观特征的变化25
• 2.2.2 堆肥过程中温度的变化25-26
• 2.2.3 堆肥过程中含水率的变化26
• 2.2.4 堆肥过程中pH的变化26-27
• 2.2.5 堆肥过程中电导率(EC)的变化27-28
• 2.2.6 堆肥过程中总有机碳的变化28
• 2.2.7 堆肥过程中总氮的变化28-29
• 2.2.8 发芽指数(GI)的变化29-30
• 2.3 小结30-32
• 第三章 堆肥过程中青霉素残留对B-内酰胺酶基因型菌群的诱导富集效应32-52
• 3.1 主要实验试剂及仪器32-33
• 3.2 青霉素残留降解的动态变化33-34
• 3.2.1 超高效液相色谱(UPLC)检测条件33
• 3.2.2 加速溶剂萃取(ASE)与SPE净化33-34
• 3.2.3 超高效液相色谱检测(UPLC)34
• 3.3 堆肥过程中B-内酰胺酶基因型菌群的数量变化34-37
• 3.3.1 目的基因引物、探针序列34-35
• 3.3.2 qPCR标准曲线的绘制35
• 3.3.3 标准品的制作35-37
• 3.3.4 标准曲线的绘制37
• 3.3.5 堆肥样品分析37
• 3.4 结果讨论37-50
• 3.4.1 青霉素钠标准曲线的绘制37
• 3.4.2 青霉素残留降解曲线及其降解动力学曲线37-38
• 3.4.3 青霉素降解动力学38-39
• 3.4.4 青霉素菌渣堆肥过程中细菌、放线菌数量变化39-40
• 3.4.5 β-内酰胺酶基因型菌群在堆肥过程中的数量变化40-50
• 3.5 小结50-52
• 第四章 一株青霉素降解新菌的分类鉴定及降解特性分析52-64
• 4.1 主要实验材料和仪器52-53
• 4.1.1 实验药品、试剂及仪器52
• 4.1.2 培养基52-53
• 4.1.3 模式菌株53
• 4.2 实验方法53-56
• 4.2.1 青霉素降解菌株的分离、筛选53
• 4.2.2 基因组DNA提取、PCR扩增及序列分析53-54
• 4.2.3 菌株PC-2~T表型特征分析54-55
• 4.2.4 菌株PC-2~T细胞脂肪酸测定55
• 4.2.5 菌株PC-2~T遗传特征分析55
• 4.2.6 菌株PC-2~T降解特性分析55-56
• 4.3 实验结果56-63
• 4.3.1 青霉素降解菌株的分离与保藏56
• 4.3.2 菌株PC-2~T的形态特征56-57
• 4.3.3 细菌生长特征57
• 4.3.4 抗生素敏感性实验57-58
• 4.3.5 生理生化特征58-59
• 4.3.6 细胞脂肪酸组分59
• 4.3.7 菌株PC-2~T遗传特征59-61
• 4.3.8 菌株PC-2~T降解特性分析61-63
• 4.4 讨论63
• 4.5 小结63-64
• 第五章 结论与展望64-66
• 5.1 结论64-65
• 5.2 展望65-66
• 参考文献66-73
• 致谢73-74
• 在校期间发表论文情况74

【参考文献】

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本文编号：975984