药用野生稻中淀粉合成酶基因家族的进化

发布时间：2017-10-08 01:14

  本文关键词：药用野生稻中淀粉合成酶基因家族的进化

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【摘要】：世界上近一半人口都以稻米为食,而稻米中最主要的成分就是淀粉,各国的科学家从基础研究和应用等领域对水稻淀粉的合成过程和个体基因功能进行了大量的探索研究,为水稻优质、高产、高抗做出了重要贡献。对于控制淀粉合成的淀粉合成酶基因一直是科学研究关注的焦点,其重要性不言而喻。药用野生稻(Oryza officinalis Wall.ex Watt)隶属于禾本科(Poaceae),是世界上最重要的粮食作物——水稻(O.sativa L.)的亲缘种,也是其遗传改良的重要基因源。将药用野生稻做为实验对象进行深入研究,不但可以把握淀粉合成酶基因在同属内的自然进化规律,而且可以为水稻的遗传育种和品质改良提供必要的分子数据。鉴于此,本研究利用水稻基因组数据,在全面挖掘栽培稻淀粉合成酶基因家族整体进化细节的基础上,选取药用野生稻作为植物材料,通过转录组测序、基因体外扩增和测序以及qRT-PCR基因表达定量等实验手段,全面总结了药用野生稻内淀粉合成酶基因家族的基因构成、序列特点以及表达分化等进化特点并探讨了它们和栽培稻同源基因之间的具体差异。具体研究结果如下:一、利用第二代测序技术,对药用野生稻(O.officinalis)叶转录组进行了调查。结果获得大约2.3×107个高质量的读条,每个读条长100bp,总计约2.1×109个碱基长。采用De Novo方式重头组装出非冗余的单基因68132条,总长度约83Mbp。通过和NCBI、SWISS、KEGG、COG、GO和InterPro等数据库内数据的相似性比较,这些单基因的功能被进一步注释。二、通过对栽培稻(O.sativa)全基因组的全面分析,发现水稻的淀粉合成酶基因家族共包括11个成员(SSI、SSII-1、SSII-2、SSII-3、SSIII-1、SSIII-2、SSIV-1、SSIV-2、SSV、GBSSI和GBSSII),分别定位在1、2、4-8和10号等8个染色体上,基因结构各异,各包括8-20个外显子,mRNA编码长度在1827 bp-4662 bp之间变动。药用野生稻的叶转录组中共有18728个读条能够顺利匹配到11个栽培稻淀粉合成酶基因上,经拼接,我们获得了8个淀粉合成酶基因(SSI、SSII-1、SSII-2、SSIII-1、SSIII-2、SSIV-2、SSV和GBSSII)的完整编码序列,这8个基因和它们栽培稻同源基因之间,在氨基酸序列水平的相似性均可以达到93%以上。此外,基于Ka/Ks的统计检验证明这8个基因在野生和栽培状态均处于严格的纯化之下。此外,有3个在栽培稻中出现的淀粉合成酶基因(SSII-3、SSIV-1和GBSSI)由于在药用野生稻叶转录组中出现的读条过少而未能成功拼接成完整基因,初步分析可能和这些基因在叶中表达水平偏低有关。三、根据已知的栽培稻、拟南芥、玉米和我们得到的药用野生稻序列,我们构建了最大似然性系统进化树,结果发现4个物种的淀粉合成酶基因完全按照基因功能进行聚类,药用野生稻的8个基因全部置于不同功能分支内,显示了我们基于转录组识别的淀粉合成酶基因的正确性。四、为了验证药用野生稻中淀粉合成酶各基因是否存在不同的表达,我们根据药用野生稻8个完整基因(SSI、SSII-1、SSII-2、SSIII-1、SSIII-2、SSIV-2、SSV和GBSSII)以及水稻3个淀粉合成酶基因(SSII-3、SSIV-1和GBSSI)的保守区设计mRNA引物,并分别在药用野生稻的叶和种子两个不同器官内对这11个基因实施了一系列qRT-PCR实时定量操作。结果表明,淀粉合成酶基因家族不同成员的表达差异不但在相同器官,而且在不同器官间均有出现。例如GBSSI基因在不同器官间存在着明显的时空特异表达现象,在叶中表达量较低,但在种子则高效表达。
【关键词】：药用野生稻 转录组 淀粉合成酶 基因家族
【学位授予单位】：曲阜师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 第一章 综述9-20
• 1.1 淀粉简介9-12
• 1.1.1 淀粉的结构9-10
• 1.1.2 直链淀粉简介10-11
• 1.1.3 支链淀粉简介11-12
• 1.2 淀粉生物合成的相关酶12-16
• 1.2.1 颗粒结合型淀粉合成酶GBSS12-14
• 1.2.2 可溶性淀粉合成酶SSS14-16
• 1.2.3 淀粉分支酶SBE16
• 1.2.4 ADP焦磷酸化酶AGPase16
• 1.2.5 淀粉去分支酶SBE16
• 1.2.6 其它参与淀粉合成的酶16
• 1.3 药用野生稻概述16-18
• 1.4 研究目的及意义18-20
• 第二章 实验材料和方法20-27
• 2.1 植物材料的选取20
• 2.2 实验方法20-26
• 2.2.1 植物总RNA的提取和文库的构建20
• 2.2.2 反转录cDNA的第一条链20-21
• 2.2.3 PCR扩增21-22
• 2.2.4 序列测定22-23
• 2.2.5 实时荧光定量PCR反应及各项参数23-25
• 2.2.6 Real-time反应条件的优化25-26
• 2.3 实验数据处理26-27
• 2.3.1 转录组数据组装及功能注释26
• 2.3.2 基因表达差异的计算26-27
• 第三章 药用野生稻叶转录组测序分析及淀粉合成酶基因家族的识别27-41
• 3.1 转录组数据统计27-32
• 3.1.1 应用BLAST对转录组进行功能注释28-29
• 3.1.2 基于GO（Gene Ontology）和InterPro的功能注释29-30
• 3.1.3 通过InterPro预测蛋白功能30
• 3.1.4 COG功能分类和KEGG代谢途径分类30-32
• 3.2 淀粉合成酶基因家族的识别32-41
• 3.2.1 栽培稻中淀粉合成酶基因家族32
• 3.2.2 栽培稻中淀粉合成酶基因的结构32-34
• 3.2.3 转录组原始数据进行分析34
• 3.2.4 药用野生稻淀粉合成酶基因组成和序列特点34-37
• 3.2.5 同源性与谱系关系分析37-39
• 3.2.6 讨论39-41
• 第四章 淀粉合成酶基因家族基因表达及分析41-47
• 4.1 RNA纯度和完整性分析41
• 4.2 淀粉合成酶基因家族相关基因的引物设计41-42
• 4.3 测序结果42
• 4.4 淀粉合成酶基因家族定量分析42-46
• 4.4.1 实时荧光定量PCR各项参数指标42-44
• 4.4.2 淀粉合成酶基因家族在叶子中的的相对表达及分析44-45
• 4.4.3 淀粉合成酶基因家族在种子中的的相对表达及分析45-46
• 4.5 讨论46-47
• 附录47-49
• 参考文献49-53
• 在读期间发表的学术论文及研究成果53-54
• 致谢54

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本文编号：991151