保幼激素触发蛋白激酶C信号转导通路激活受体介导卵黄原蛋白吸收的分子机制

发布时间：2020-03-20 20:06

【摘要】：飞蝗(Locusta migratoria,Lm)是我国重要的农业害虫,食性广泛、生殖能力强大,给农业生产造成巨大损害,其生殖分子机制的研究对于蝗灾治理有重要意义。昆虫卵黄发生(Vitellogenesis)是生殖过程中最重要的环节之一,是体现强大生殖能力的基础。在卵黄发生期,昆虫脂肪体合成卵黄原蛋白(Vitellogenin,Vg)并通过血淋巴运输至卵巢,由卵母细胞表面的特异性受体—卵黄原蛋白受体(Vitellogenin receptor,VgR)介导并吸收,继而在胞内加工成为卵黄蛋白(Vitellin,Vn),构成昆虫胚胎发育的主要营养物质。VgR在Vg吸收环节中扮演着关键角色,其中分子机制的解析一直受到领域科学家们的关注。昆虫卵黄原蛋白受体属于低密度脂蛋白受体超家族(Low density lipoprotein receptor,LDLR)成员,目前为止,已有30多种昆虫的VgRs家族成员被研究报道,其中关于飞蝗VgR的研究显示,其介导Vg吸收过程受到体内保幼激素(juvenile hormone,JH)调控。JH是昆虫体内最重要内分泌激素之一,在昆虫生殖发育过程中发挥关键调控作用,然而由于JH信号通路研究进展较为缓慢,导致VgR受体介导卵母细胞吸收Vg的分子调控机制至今未明。因此,本论文以飞蝗作为研究对象,从飞蝗VgR功能解析着手,通过生物信息学、分子生物学、生物化学及细胞生物学等相关技术手段,对LmVgR受体功能及上游JH调控机制进行研究,以期解析JH信号转导通路激活VgR并介导卵母细胞吸收Vg的分子机制。首先通过已知飞蝗VgR基因序列片段并借助RACE技术获取了飞蝗VgR基因序列全长。利用生物信息学方法对其基因结构及系统进化水平进行分析,获得了LmVgR序列的生物学信息。运用原核重组表达技术重组表达VgR部分片段,经纯化并免疫新西兰大白兔后制备LmVgR多克隆抗体。然后使用荧光定量PCR和Western Blot等分别从mRNA与蛋白水平上检测了LmVgR的表达模式,结合飞蝗卵巢中LmVg的变化模式,发现LmVgR表达与卵巢吸收Vg呈现正相关性。基于RNAi的LmVgR基因沉默实验显示,LmVgR干扰后卵巢对LmVg的吸收显著下降。JH体内诱导实验显示,JH能够显著提升卵巢对LmVg的吸收;LmVgR沉默能够显著抑制JH诱导下卵巢吸收LmVg。上述结果表明,JH能够通过LmVgR促进飞蝗卵巢吸收Vg。飞蝗卵巢发育阶段Western blot显示,LmVgR的蛋白表达模式存在翻译后修饰,并且其翻译后修饰与卵巢Vg吸收也呈现正相关性。通过碱性磷酸酶处理以及基于VgR抗体、蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)底物磷酸化抗体的IP和Western blot实验确定VgR存在磷酸化修饰,且该修饰为PKC催化的丝氨酸磷酸化。通过药理学实验显示,JH能够显著诱导VgR磷酸化修饰,并且PKC抑制剂(Staurosporine)显著抑制JH诱导的VgR磷酸化修饰,然而,钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(calcium/calmodulindependent protein kinase II,CaMK II)的抑制剂(KN-93)不能抑制JH诱导的VgR磷酸修饰。进一步通过受体酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinase,RTK)抑制剂SU6668、G-蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor,GPCR)抑制剂Suramin和磷酯酶C(phospholipase C,PLC)抑制剂U73122等进行阻断处理,结果显示,Suramin与U73122能够显著抑制JH诱导LmVgR磷酸化。通过卵巢吸收功能研究发现,JH促进卵巢吸收Vg,并且PKC抑制剂Staurosporine能够显著抑制卵巢对Vg吸收。免疫共沉淀显示,JH能够触发VgR-Vg之间相互作用,并且Staurosporine能够显著抑制VgR与Vg相互结合。上述结果暗示了JH能够通过GPCR-,PLC-,PKC-信号转导通路调控VgR磷酸化修饰,继而调节VgR与Vg之间相互作用及卵巢吸收Vg。本论文研究结果表明,JH能够通过PKC激活LmVgR的磷酸化,进而调控LmVgR与LmVg的结合,从而介导卵母细胞对卵黄原蛋白吸收,从而初步解析了保幼激素激活飞蝗VgR并介导卵巢吸收Vg的分子机制。研究结果丰富了JH非基因组信号转导通路及其在昆虫生殖发育调控机制研究中的进展,为飞蝗绿色防控提供了一定的借鉴意义。
【图文】：

图 3-1 飞蝗 VgR 功能结构域图。为 ExpasyTMHMM2.0 与 SMART 对飞蝗 VgR 结构预测整合后的结果，包含该家族的五种经域，以不同的色块表示不同的结构。其中，棕色为信号肽，蓝色为 A 型重复序列，黄色为 B 序列，橙色为 YWXD 重复基序，红色为 O-型糖基化位点，绿色为跨膜域，紫色为胞质尾域。Figure 3-1 Functional structure domain of LmVgR.同时利用 MEGA 6.0 将飞蝗 VgR 与已知的二十多种其他昆虫的 VgR 和脊椎动物LR 进行同源比对，，并构建了系统进化树（图 3-2）。结果证明，整个 LDLR 超家别是昆虫的VgRs之间具有着的高度保守性和同源性，飞蝗VgR与蜚蠊目昆虫的V有最高的同源性，其次是膜翅目的 VgRs。

图 3-2 LDLR 超家族系统进化树。用 MAGE 5.0 进行分析作图，涉及的序列号如下：SinVgR (AAP92450.1), HsaVgR (EFN84770.MroVgR (XP_003704660.1),AmeVgR (XP_001121707.2), NviVgR (XP_001602954.2), PamVgR(BAC02725.2), BgeVgR (CAJ19121.1), RmaVgR (BAE93218.1), NluVgR (ADE34166),ApisLDLR(XP_001944152.2), BtaVgR (ADM34986.1), PhuVgR (XP_002423121.1), TcaVgR (XP_968903.2),aeVgR (AAK15810.1),AgaVgR (EAA06264.6), BdoVgR (AGE83235.1), DmeVgR (GI21507), DplV(EHJ76019.1), HarVgR (AGF33811.1), SliVgR (ADK94033.1),AseVgR (AFV32171.1),ApeVgR(AEJ88360.1), BmoVgR (ADK94452.1), PmoVgR (ABW79798.1), MroVgR (ADK55596.1), DvaVg(AAZ31260.3),Ahe (AGQ57038.1), GgaVLDLR (NP_990560.1), XlaVLDLR (NP_001084168.1),HsaLDLR (EAX11280.1), PabLDLR (XP_002812613.1),AmeLDLR (XP_002916562.1), PhoLDLR(XP_005977011.1), BtaLDLR (DAA32788.1)。Figure 3-2 Phylogenetic tree for LDLR superfamily..1.2 飞蝗 VgR 特异性抗体制备为便于后续对飞蝗 VgR 功能的研究，我们着手制备了飞蝗 VgR 的特异性兔源多
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S433.2

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本文编号：2592127