核盘菌转录因子SsMCM1互作蛋白的研究

发布时间：2020-06-24 13:32

【摘要】：核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib)de Bary)是一种世界性分布的典型的死体营养型植物病原真菌;寄主范围广,能侵染至少75科278属408种植物,包括重要的农作物和果蔬,如大豆、菜豆、青豆、向日葵、油菜、番茄、青椒、莴苣及其它许多植物,造成严重的经济损失。MADS-box基因家族是真核生物中重要的转录因子,存在于植物、昆虫、线虫、真菌、低等脊椎动物及哺乳动物中,可调控初级代谢、细胞周期、细胞识别等多种细胞功能。本课题组前期克隆了核盘菌MADS-box基因家族转录因子SsMCM1,经过研究表明SsMCM1具有高度保守的DNA结合结构域,属于MADS-box家族中的SRF亚族。SsMCM1基因功能的研究表明,SsMCM1参与调控核盘菌菌丝营养生长、致病力、有性生殖等方面。在此工作基础上,为挖掘与SsMCM1转录因子互作的蛋白,建立SsMCM1调控网络开展了如下研究:1、构建了pGBKT7-SsMCM1载体,并将其转化酵母细胞进行毒性和自激活检测,结果表明pGBKT7-SsMCM1载体对酵母细胞无毒性,无自激活活性。利用酵母双杂交技术对核盘菌c DNA文库进行筛选和共转验证,初步获得13个与SsMCM1转录因子互作的蛋白,分别为:Ss IP31、Ss IP34、Ss IP37、Ss IP38、Ss IP43、Ss IP44、Ss IP63、Ss IP80、Ss IP86、Ss IP98、Ss IP99、Ss IP100、Ss IP106。2、对初步获得的13个与SsMCM1转录因子互作的蛋白进行测序、设计引物、克隆基因,并将其全长基因连接到p GADT7载体上,与pGBKT7-SsMCM1载体共转酵母,结果表明,初步筛选的互作蛋白中有12蛋白与SsMCM1转录因子互作。3、对SsMCM1转录因子进行生物信息学分析,并结合酿酒酵母中MCM1转录因子信号通路进行比对,发现在核盘菌中存在一个与酵母MCM1转录因子下游蛋白Cdc28高度同源的蛋白SSIG_02296,经克隆获得该基因,将其命名为Ss Cdc28。然后构建pGBKT7-Ss Cdc28载体,通过酵母双杂交在已获得的12个与SsMCM1转录因子互作的蛋白中,筛选出来一个与Ss Cdc28互作的蛋白Ss IP86。4、为进一步验证蛋白之间的互作,构建了SsMCM1-Ss IP86双分子荧光互补载体,进行拟南芥原生质体转化,利用共聚焦显微镜进行荧光观察,结果表明SsMCM1与Ss IP86能进行互作,且互作是在细胞核内进行。本实验通过酵母双杂交筛选出12个与SsMCM1转录因子互作的蛋白,双分子荧光互补结果表明SsMCM1与Ss IP86能进行互作,且互作是在细胞核内进行,克隆并获得位于SsMCM1转录因子下游的蛋白Ss Cdc28,酵母双杂交表明SsMCM1与Ss IP86互作,Ss IP86与Ss Cdc28互作,明晰了SsMCM1-Ss IP86-Ss Cdc28之间的互作关系,为解析核盘菌转录因子SsMCM1的调控网络与调控机制奠定了基础。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S432.44

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本文编号：2727924