大丽轮枝菌果胶裂解酶VdPEL1诱导植物免疫和致病性的功能分析

发布时间：2020-07-23 10:07

【摘要】：大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)是一种寄主广泛的土传性植物病原真菌,可引发植物黄萎病。在大丽轮枝菌侵染植物过程中,会分泌大量的细胞壁降解酶,破坏植物细胞壁结构从而促进侵染。同时,植物可以特异性识别植物细胞壁降解酶,激活自身的免疫反应,抵御病原菌的入侵。对大丽轮枝菌细胞壁降解酶的深入研究,有助于了解其致病性和诱导植物抗病性的机理,从而为黄萎病防治提供见解与思路。本研究从大丽轮枝菌中分离鉴定出一个果胶裂解酶VdPEL1,可以作为毒力因子,在大丽轮枝菌致病性中发挥作用,同时VdPEL1能够诱导植物免疫反应,增强植物抗病性。本研究中获得以下结果:1.VdPEL1在大丽轮枝菌侵染植物过程中发挥作用通过参考V.dahliae Vd991菌株侵染棉花早期的分泌组学数据,鉴定到一个分泌的果胶裂解酶,命名为VdPEL1。qPCR数据分析结果显示,在大丽轮枝菌Vd991侵染棉花和烟草植株的早期,VdPEL1基因被显著诱导表达,说明VdPEL1可能参与了侵染过程。通过基因敲除获得了两个大丽轮枝菌VdPEL1基因缺失突变体菌株?VdPEL1-1和?VdPEL1-2。与野生型菌株相比,?VdPEL1-1和?VdPEL1-2表现出正常的生长表型。致病性检测结果显示,缺失突变体菌株相比于野生型菌株,其致病力显著下降,而VdPEL1基因缺失突变体回补菌株EC-1和EC-2则恢复了与野生型菌株相似的致病性。2.VdPEL1蛋白真核表达与酶活性检测成功构建VdPEL1真核表达载体pPICZaA-VdPEL1,转化毕赤酵母感受态细胞,通过诱导表达和纯化后得到了高纯度和浓度的重组蛋白。SDS-PAGE检测结果显示VdPEL1重组蛋白大小为30 kDa。纯化后的VdPEL1蛋白具有果胶裂解酶活性,且其酶活性受温度,Ca~(2+)浓度和pH影响。3.VdPEL1诱导植物细胞坏死反应VdPEL1可以诱导烟草产生细胞坏死反应,其最低作用浓度为0.3μM。同时VdPEL1可以诱导多种植物的细胞坏死反应,包括:番茄,大豆和棉花。瞬时表达VdPEL1也可以诱导植物的细胞坏死反应,且VdPEL1瞬时表达诱导植物细胞坏死的能力需要其信号肽。VdPEL1诱导植物细胞坏死反应的能力依赖其果胶裂解酶活性,VdPEL1~(REC)(无果胶裂解酶活性的VdPEL1)不能诱导植物产生细胞坏死反应。4.VdPEL1诱导植物产生抗病性VdPEL1诱导植物产生PTI反应,包括:ROS和胼胝质的积累,电解质渗漏,以及植物防御相关基因的上调表达。此外,VdPEL1可以增强植物的抗病性,烟草叶片注射VdPEL1后,对灰霉菌和大丽轮枝菌抗性显著增强,VdPEL1处理过的棉花植株相比于PEVC和VdPEL1~(REC)处理过的棉花植株,接种大丽轮枝菌后,显著减轻了黄萎病症状。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S432.44
【图文】：

循环图,黄萎病,循环图,植物

国农业科学院硕士学位论文第一章的抗逆能力，在温度范围（-30-80℃）内均可以存活[13]。黄萎病作为一种单循环病害，感病植株残体及土壤中存活的微菌核是第二年黄萎病发生的侵染源（图 1.1）[14,15]。微菌核在适宜的萌发温度条件（最适温度： 25-30℃）下萌发，萌的微菌核从植物根毛或根尖部位侵入植物体内。当微菌核形成芽管或菌丝结构时，它可以延植物的维管束组织中并产生大量分生孢子。分生孢子借助植物的蒸腾作用，作为向植物地上运输的动力，从根部扩展至植物的茎部和叶片，最终导致整株植物感病。感病植物的叶片逐化，脱落，植物枯萎，果实脱落，导致植物产量和质量下降。随着感病植物逐渐死亡，寄生丽轮枝菌进入腐生阶段并在植物残体中产生新的微菌核。而这些新的微菌核从植物残体进入中休眠存活，作为第二年黄萎病的初始侵染源，进入第二个病害循环。

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图 1.2 植物免疫系统的 Zigzag 模型Figure 1.2 A zigzag model illustrates the quantitative output of the plant immune system. PAMPs 或 MAMPs 的信号直接传至细胞内，因此需要与 RLKs 形成复合体域实现信号转导 [56, 57]。图 1.3 集中展示了目前被广泛研究的 PAMPs2 作为第一个被鉴定的植物模式识别受体（RLK），可以特异性地识别 fl2 基因的拟南芥中，flg22 不能被正确的识别以及激活拟南芥的免疫反应。的受体，EF-TU 处理后的拟南芥 EFR 突变体植株不能产生 PTI 反应[46]。eceptor kinase 1）和 SOBIR1（SUPPRESSOR OF BIR1-1）是目前研究最为K1 作为植物免疫系统的中心调控者，与其他 PRRs 共同参与植物对 PAM例如 FLS2 和 FER 接收到 flg22 和 ET-TU 信号后，与 BAK1 形成复合体，[59]。拟南芥 RLP30 可以识别核盘菌 PAMPSCFE1，诱导乙烯的大量产生0]。番茄 RLP SlEix2 直接与木聚糖酶（EIX）互作，参与植物的抗病过程少胞内的激酶结构域，往往需要与 SOBIR1 形成复合体，完成对 PAMP一些 PAMPs 的过敏性坏死反应也依赖于 BAK1 和 SOBIR1，比如疫霉属灰霉菌 PAMPs BcSpl1, Bcxyl1 和 BcXYG1，大丽轮枝菌 PAMPs VdEG1[29, 51, 52, 64, 65]。

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图 1.3 PRRs 和对应的 PAMPsFigure 1.3 Representative PRRs and their ligands物的 R 蛋白可以直接与 effectors 结合，例如稻瘟菌效应子 AvrPi-ta 可以直接与水稻 R 蛋白互作，激活水稻 ETI 反应[67]。R 蛋白除了可以直接和 effector 互作外，R 蛋白也可以间接识ffector。例如丁香假单胞杆菌 efferctor AvrPphB 可以与植物 PBS1 蛋白酶直接互作，AvrPphB PBS1 的产物可被 R 蛋白 RPS5 识别，激活植物 ETI 反应[68]。相比 PTI 反应，ETI 反应更快烈，往往伴随着过敏性细胞坏死反应（hypersensitive response，HR）的产生[40]。.2.3 植物的系统诱导抗病性植物的系统诱导抗病性主要包括系统获得抗病性（systemic acquired resistance, SAR）和诱统抗病性（induced systemic resistance, ISR） [69, 70]。系统获得抗病性是指植物感知病原菌击，免疫信号由初始侵染点迅速传递到至整株植株，SAR 过程往往伴随着一系列的免疫事件括 HR 反应、ROS 和胼胝质的积累、以及植物防御相关基因的表达等。诱导系统抗病性是指物根际周围的微生物诱导产生的系统抗病性。根据报道，假单胞菌，芽孢杆菌和木霉菌等均导 ISR。比于 ISR，SAR 诱发产生的抗病性更为持久，对多种病原微生物的抗性作用显著[71

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