甜菜适应碱性盐胁迫的生理机制及其转录组分析

发布时间：2020-09-05 14:17

　　 土壤盐碱化是限制作物产量的主要非生物胁迫因素之一。甜菜作为世界上主要的糖料作物之一,具有较强的耐盐碱性。研究甜菜的耐盐碱机制,对盐碱土的充分开发利用,推动我国农业的可持续发展,具有重要意义。为探究甜菜对碱性盐胁迫的适应机制,本试验选用两个耐性不同的甜菜品种KWS0143和Beta464作为供试材料,利用碱性盐(摩尔比为2:1的NaHCO_3和Na_2CO_3的混合物)溶液进行处理,对碱性盐胁迫后两个甜菜品种的生长指标、光合特性、渗透调节物质、抗氧化酶、离子平衡、多胺和有机酸代谢进行深入分析,结合细胞超微结构的变化,并通过对耐性较强的品种KWS0143进行高通量测序,鉴定甜菜响应碱性盐胁迫的差异表达基因及lncRNA与miRNA,从形态—解剖结构—生理—分子等层面系统阐述了甜菜对碱性盐胁迫的适应性机制。所获得的耐性相关基因可以丰富甜菜抗性基因资源库,为通过转基因技术培育耐盐碱的甜菜新品种,进一步挖掘甜菜耐盐碱潜力提供理论依据,对丰富甜菜学科理论具有重要意义。主要研究结果如下:(1)碱性盐胁迫程度的加剧,导致甜菜幼苗净光合速率、实际光化学效率、光合色素含量、植株干物质重和根系形态指标的显著下降。碱性盐胁迫导致甜菜叶片净光合速率的降低是非气孔因素造成的。75 mM碱处理使两个品种的叶绿体均有所变长,基质片层变得松散,嗜锇滴数增加。Beta464的光合能力、干物质积累和根系形态指标等在碱性盐胁迫下的受抑制程度比KWS0143严重。根冠比的变化可能也是甜菜适应碱性盐胁迫的一种方式。(2)碱性盐胁迫下Beta464叶片和根系的生物膜受损伤比KWS0143严重,两个甜菜品种的叶片的膜脂过氧化程度比根系严重。在脯氨酸、甜菜碱和可溶性糖三种渗透调节物质中,脯氨酸含量在碱性盐胁迫下上升幅度最大,可能在甜菜适应碱性盐胁迫过程中发挥的作用更大。在响应碱性盐胁迫过程中,两个甜菜品种根系的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性强于叶片,说明根系的抗氧化能力可能强于叶片。KWS0143在碱性盐胁迫下的渗透调节能力和抗氧化能力总体强于Beta464。(3)随着碱性盐胁迫程度的加剧,甜菜叶片和根系中Na~+含量的增加使得K~+、Ca~(2+)不断减少。甜菜可通过叶片向外分泌Na~+离子缓解Na~+毒害。在响应碱性盐胁迫过程中,KWS0143的K~+、Na~+选择性运输系数提高,根系对Na~+的区域化作用加强。KWS0143较Beta464具有更强的维持Na~+、K~+、Ca~(2+)离子平衡的能力。(4)游离态腐胺(Put)、精胺(Spm)和亚精胺(Spd)参与了甜菜对碱性盐胁迫的响应,碱性盐胁迫下三种游离态多胺含量的上升,也刺激了多胺氧化酶和二胺氧化酶活性的增强。在三种游离态多胺中,Spd在碱性盐胁迫下含量最高,上升幅度最大,可能在适应碱性盐胁迫中起主要作用。碱性盐胁迫不断加重后,KWS0143叶片和根系的游离态Spm含量均高于Beta464。甜菜根系和叶片的三种游离态多胺含量与脯氨酸、可溶性糖含量及POD活性等呈显著的正相关,说明碱性盐胁迫下游离态多胺可能促进了脯氨酸等渗透物质的合成,增强了POD等抗氧化酶的活性。(5)碱性盐胁迫下甜菜可通过增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性推动三羧酸循环的进行,促进有机酸合成,以缓解碱性盐胁迫带来的pH伤害。在酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸6种有机酸中,酒石酸可能在甜菜抵御pH胁迫方面起的作用更大。甜菜也可通过根系分泌酒石酸、苹果酸和乙酸参与根外pH的调节。碱性盐胁迫较重时,KWS0143的苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸含量高于Beta464,而酒石酸和乳酸的含量低于Beta464。(6)转录组测序结果表明,在短时间和长时间的碱处理下,分别有573和261个基因显著上调表达,403和122个基因显著下调表达,其中有52个共同的上调表达基因和30个共同的下调表达基因在短时间和长时间的碱性盐胁迫下均被鉴定了出来。在短时间碱性盐胁迫下,D-3-磷酸甘油酸脱氢酶1基因LOC104901403、亚油酸盐13S-脂氧合酶2-1基因LOC104889933和2-氧异戊酸脱氢酶α亚基1基因LOC104895418、脂肪酸过氧化氢裂合酶基因LOC104901567和乙烯利非敏感蛋白2基因LOC104884677均显著上调表达,谷氨酰-tRNA还原酶1基因LOC104905095显著下调;而在长时间的碱性盐胁迫下,金属耐性蛋白11基因LOC104886952显著上调,谷氨酰-tRNA还原酶1基因LOC104905095和ω-6脂肪酸去饱和酶基因LOC104900797显著下调。可变剪切分析表明,在短时间和长时间的碱性盐胁迫处理下分别有8和16个差异表达基因发生了可变剪切。碱性盐胁迫后甜菜差异表达基因发生的可变剪切的主要类型是:可变3′端剪切位点和外显子跳跃。(7)高通量测序鉴定出8535个lncRNA。lncRNA的长度为201-12882 nt,平均长度为424nt。LNC_003498和LNC_003048均被预测为gma-miR4995的前体,而LNC_003418被预测为hbr-miR6173的前体。在短时间和长时间的碱性盐胁迫下分别有54和37个lncRNA表达水平发生显著变化。对这些差异表达lncRNA的靶基因进行预测,发现了一些可能与甜菜逆境响应相关的lncRNA及靶基因。LNC_001910的靶基因LOC104902979参与控制超氧化物歧化酶的合成,LNC_007731与编码过氧化物酶的基因LOC104906740存在共表达现象,LNC_000160及其靶基因LOC104888423(水杨酸诱导蛋白同系物)均在短时间碱处理下显著上调表达,LNC_000365与上调的离子转运蛋白基因LOC104892091共表达。(8)本文鉴定出甜菜的268个已知miRNA,并预测出61个novel miRNA。96个已知miRNA和45个novel miRNA在碱处理后差异表达,例如osa-miR166m、lus-miR159b、gma-miR168b和novel_25。对碱性盐胁迫响应miRNA的靶基因进行预测与分析,最终发现67个碱性盐胁迫响应miRNA可能作用于45个基因。对差异表达miRNA靶基因的GO分析表明,差异表达miRNA的大量靶基因富集在“氧化还原过程”,如多酚氧化酶基因LOC104900758。
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S156.4;S566.3
【部分图文】：

本研究的技术路线

东北农业大学农学博士学位论文.2.4 数据处理与分析利用 Excel 2016 进行数据整理与图表制作，利用 SPSS 20.0 采用 LSD 法进行方差分析和比较。.3 RNA 测序试验.3.1 甜菜响应碱性盐胁迫的基因的发现与分析3.1.1 碱性盐处理及取样处理前的幼苗培养条件同 2.2.1。

图 2-2 lncRNA 筛选流程图Fig. 2-2 Screening process of lncRNAs.3.2 甜菜响应碱性盐胁迫的 lncRNA 的发现与分析3.2.1 碱性盐处理及取样同 2.3.1.1。3.2.2 RNA 提取、文库构建及 RNA 测序同 2.3.1.2。3.2.3 lncRNA 的筛选与碱性盐胁迫响应 lncRNA 的鉴定lncRNA 的筛选流程见图 2-2。在进行筛选之前，我们首先使用 Cuffmerge 软件，对各样接得到的转录本进行合并，并去掉其中链方向不确定的转录本，得到本次测序完整的转录息。之后，对合并的转录本集合进行 lncRNA 的筛选，主要步骤如下：（1）转录本 exon 个数筛选：过滤转录本拼接结果中大量低表达量，低可信度的单外显录本，选择 exon 个数≥ 2 的转录本（植物筛选会加入单外显子转录本）；（2）转录本长度筛选：选择转录本长度> 200bp 的转录本；

本文编号：2813121