靶向农药残留检测的重组丁酰胆碱酯酶突变体的合理设计
发布时间：2021-06-25 13:16
有机磷农药因具有高效、种类繁多、低价等特点而被广泛使用。由于有机磷农药的过度使用导致严重的环境污染及非靶向生物体有严重的毒性。因此加强对环境、食品中的有机磷农药含量的检测十分重要。检测有机磷农药含量最常用的酶抑制法所用的酶源为乙酰胆碱酯酶（AChE）。 AChE作为重要的酶源在检测中仍存在以下问题：灵敏度有待提高；其次因有机磷类农药数量庞大,单一AChE无法满足所有有机磷化合物检测。因此我们希望通过生物技术,以AChE结构类似丁酰胆碱酯酶BChE作为改造对象以期能够获得灵敏度更好,检测范围更广的酶源。BChE与AChE在结构和性质上相似,且早期已有科学家尝试用丁酰胆碱酯酶来作为检测的酶源。通过对BChE结构的深刻学习和认识,我们对人源丁酰胆碱酯酶ABChE活性腔中部分重要位点的改造,利用定点突变、真核表达、蛋白质纯化以及酶动力学检测等手段共得到近40个ABChE突变体,并且成功建立了突变ABChE检测有机磷的筛选模型。通过双分子速率常数测定发现hAChE对丙溴磷无法识别,ABChE较hAChE对敌敌畏、丙溴磷、辛硫磷识别效果更佳。而通过突变体筛选,找到F227、S287、N68、P28...
【文章来源】：华中师范大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 背景介绍
1.1 有机磷农药残留检测的研究进展
1.1.1 有机磷农药简介
1.1.2 有机磷农药的特点
1.1.3 有机磷农药残留检测分析方法
1.1.4 不同残留检测的方法的比较
1.2 酶抑制法用于检测有机磷农药的研究进展
1.2.1 胆碱酯酶的性质、功能以及晶体结构
1.2.2 有机磷农药与胆碱酯酶的相互作用研究
1.2.3 现有改造胆碱酯酶的研究进展
1.3 选题依据和研究思路
第二章 靶向机磷农药残留的丁酰胆碱酯酶突变体的合理设计
2.1 实验材料
2.1.1 实验仪器
2.1.2 实验试剂
2.1.3 实验溶液的配置
2.2 实验方法
2.2.1 定点突变
2.2.2 氯化钙方法制备感受态细胞
2.2.3 质粒在大肠杆菌的转化
2.2.4 试剂盒提取质粒并测定所提取质粒的浓度和纯度
2.2.5 琼脂糖核酸电泳
2.2.6 人体胚肾细胞Hek293的培养
2.2.7 质粒在真核细胞中的转染表达
2.2.8 SDS-聚丙烯凝胶电泳检测蛋白质
2.2.9 丁酰胆碱酯酶突变体的纯化方法
2.3 实验步骤
2.3.1 粗酶液的获得
2.3.2 酶促动力学反应体系
2.4 实验原理和实验数据处理
2.4.1 测活原理
2.4.2 酶促动力学常数K_m和v_(max)的处理方法
2.4.3 酶与有机磷农药的双分子速率常数k_i解离常数K_d磷酰化速率常数k_p
2.5 本章小结
第三章 有机磷农药对丁酰胆碱酯酶突变体的抑制动力学研究
3.1 突变丁酰胆碱酯酶的获得
3.1.1 人丁酰胆碱酯酶突变位点的确定
3.1.2 人丁酰胆碱酯酶突变体质粒的获得
3.1.3 突变酶的表达
3.1.4 代表性突变体A328W的纯化结果
3.2 酶与底物动力学表征
3.2.1 突变体对底物硫代乙酰胆碱(ATC)的动力学实验结果
3.3 四种常见的有机磷农药对丁酰胆碱酯酶及其突变体的抑制
3.3.1 乙酰胆碱酯酶对四种有机磷的k_i的测定
3.3.2 丁酰胆碱酯酶对四种有机磷的k_i的测定
3.3.3 各种突变体对四种有机磷的初筛
3.3.4 高亲和性突变体A328W的动力学表征
3.4 本章小结
第四章 全文总结
参考文献
研究成果及发表的论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]用于农药残留快速检测的酶生物传感器研究进展[J]. 王明珠,徐斐,曹慧,于劲松. 传感器与微系统. 2012(03)
[2]蔬菜农药残毒快速检测探讨[J]. 宋辉. 现代农业科技. 2009(03)
[3]有机磷农药产业的现状与发展趋势[J]. 贺红武. 世界农药. 2008(06)
[4]乙酰胆碱酯酶的动力学机制及其应用[J]. 郭晶,高菊芳,唐振华. 农药. 2007(01)
[5]有机磷农药酶生物传感器研究进展[J]. 王丽红,张林,陈欢林. 化学进展. 2006(04)
[6]酶抑制法在农残检测中的应用及乙酰胆碱酯酶的研究进展[J]. 温艳霞,李建科. 食品研究与开发. 2005(01)
[7]有机磷农药检测方法的应用与研究进展[J]. 吴昭阳,李政一,刘效兰,段蕾. 北京工商大学学报(自然科学版). 2004(04)
[8]有机磷农药检测方法综述[J]. 纽伟民,赵晓联,赵春城,蔡建荣. 江苏食品与发酵. 2001(01)
[9]丁酰胆碱酯酶结构研究新进展[J]. 魏婉丽,孙曼霁. 生物化学与生物物理进展. 2000(01)
[10]国内外有机磷农药的概况及对我国有机磷农药发展的看法[J]. 张一宾,孙晶. 农药. 1999(07)
本文编号：3249273
【文章来源】：华中师范大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 背景介绍
1.1 有机磷农药残留检测的研究进展
1.1.1 有机磷农药简介
1.1.2 有机磷农药的特点
1.1.3 有机磷农药残留检测分析方法
1.1.4 不同残留检测的方法的比较
1.2 酶抑制法用于检测有机磷农药的研究进展
1.2.1 胆碱酯酶的性质、功能以及晶体结构
1.2.2 有机磷农药与胆碱酯酶的相互作用研究
1.2.3 现有改造胆碱酯酶的研究进展
1.3 选题依据和研究思路
第二章 靶向机磷农药残留的丁酰胆碱酯酶突变体的合理设计
2.1 实验材料
2.1.1 实验仪器
2.1.2 实验试剂
2.1.3 实验溶液的配置
2.2 实验方法
2.2.1 定点突变
2.2.2 氯化钙方法制备感受态细胞
2.2.3 质粒在大肠杆菌的转化
2.2.4 试剂盒提取质粒并测定所提取质粒的浓度和纯度
2.2.5 琼脂糖核酸电泳
2.2.6 人体胚肾细胞Hek293的培养
2.2.7 质粒在真核细胞中的转染表达
2.2.8 SDS-聚丙烯凝胶电泳检测蛋白质
2.2.9 丁酰胆碱酯酶突变体的纯化方法
2.3 实验步骤
2.3.1 粗酶液的获得
2.3.2 酶促动力学反应体系
2.4 实验原理和实验数据处理
2.4.1 测活原理
2.4.2 酶促动力学常数K_m和v_(max)的处理方法
2.4.3 酶与有机磷农药的双分子速率常数k_i解离常数K_d磷酰化速率常数k_p
2.5 本章小结
第三章 有机磷农药对丁酰胆碱酯酶突变体的抑制动力学研究
3.1 突变丁酰胆碱酯酶的获得
3.1.1 人丁酰胆碱酯酶突变位点的确定
3.1.2 人丁酰胆碱酯酶突变体质粒的获得
3.1.3 突变酶的表达
3.1.4 代表性突变体A328W的纯化结果
3.2 酶与底物动力学表征
3.2.1 突变体对底物硫代乙酰胆碱(ATC)的动力学实验结果
3.3 四种常见的有机磷农药对丁酰胆碱酯酶及其突变体的抑制
3.3.1 乙酰胆碱酯酶对四种有机磷的k_i的测定
3.3.2 丁酰胆碱酯酶对四种有机磷的k_i的测定
3.3.3 各种突变体对四种有机磷的初筛
3.3.4 高亲和性突变体A328W的动力学表征
3.4 本章小结
第四章 全文总结
参考文献
研究成果及发表的论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]用于农药残留快速检测的酶生物传感器研究进展[J]. 王明珠,徐斐,曹慧,于劲松. 传感器与微系统. 2012(03)
[2]蔬菜农药残毒快速检测探讨[J]. 宋辉. 现代农业科技. 2009(03)
[3]有机磷农药产业的现状与发展趋势[J]. 贺红武. 世界农药. 2008(06)
[4]乙酰胆碱酯酶的动力学机制及其应用[J]. 郭晶,高菊芳,唐振华. 农药. 2007(01)
[5]有机磷农药酶生物传感器研究进展[J]. 王丽红,张林,陈欢林. 化学进展. 2006(04)
[6]酶抑制法在农残检测中的应用及乙酰胆碱酯酶的研究进展[J]. 温艳霞,李建科. 食品研究与开发. 2005(01)
[7]有机磷农药检测方法的应用与研究进展[J]. 吴昭阳,李政一,刘效兰,段蕾. 北京工商大学学报(自然科学版). 2004(04)
[8]有机磷农药检测方法综述[J]. 纽伟民,赵晓联,赵春城,蔡建荣. 江苏食品与发酵. 2001(01)
[9]丁酰胆碱酯酶结构研究新进展[J]. 魏婉丽,孙曼霁. 生物化学与生物物理进展. 2000(01)
[10]国内外有机磷农药的概况及对我国有机磷农药发展的看法[J]. 张一宾,孙晶. 农药. 1999(07)
本文编号：3249273
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/nykj/3249273.html
