辽宁省Bt菌株的分离及cry基因的克隆与表达
发布时间：2021-11-18 19:38
苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,以下简称Bt）是革兰氏阳性细菌,由于其在生长代谢过程中会产生对许多靶标害虫具有特异杀虫活性且对环境友好、对人畜无害的杀虫蛋白。已成为在世界范围内应用最为广泛的微生物杀虫剂之一。近年来,随着Bt制剂的用量逐年增大和转Bt基因植物种植面积的扩大,害虫种群对Bt杀虫蛋白产生抗性的问题也愈发严重。同时,Bt杀虫剂杀虫范围有限,持效时间短以及易受温度、紫外线等环境影响的问题也逐渐暴露出来。因此优良Bt菌株的分离筛选和Bt新型基因的发掘具有重要的研究价值和实际应用意义。本研究从辽宁省不同地区的山丘、农田和城市侵蚀地共采集524份土样,从中分离出66株野生菌株,伴胞晶体形状有球形、椭圆形、短双锥形、菱形以及不规则形等。利用PCR-RFLP方法对分离株的基因型进行鉴定,在分离株中检测出cry1Ac、cry2Aa、cry8E、cry8F四种基因型。单菌株中基因的组合类型也较为丰富,包括cry1Ac+cry8E、cry2Aa+cry8E及cry1Ac+cry2Aa+cry8E等,充分体现了辽宁省Bt资源的多样性。提取Bt分离株总蛋白,对鳞翅目害...
【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
Cry蛋白的保守结构域[92]
引 言自 1985 年至 2018 年，经过三十几年的发掘与筛选，Cry 蛋白已经被研究者们分为 78个不同类型（Cry1 到 Cry78），包含来源于 Bt 和其他芽胞杆菌的 3D 蛋白和 ETX_MTX2 家族蛋白。Cry 类蛋白质家族可分为三种类别：3D-Cry 毒素家族、Bin 毒素家族和 Mtx 毒素家族[41-42]。3D-Cry 毒素家族是 Cry 蛋白家族中最大并且研究最为广泛的类群，在该类群的蛋白结构具有高度相似的 3D 结构。结构域 I 是七个 -螺旋簇构成，主要与细胞膜的插入，毒素的活化和孔道形成有关。结构域 II 是一个反向平行的 β 折叠片构成，平行的 β-折叠结构包裹在疏水核心周围，其暴露的环形区域则参与受体识别。结构域 III 是两个反平行的 β-折叠片，结构域 II 和 III 都是通过识别特异性受体对昆虫产生特异性反应的结构[43-48]。Domain I、Domain II 和 Domain III 的结构如图 1-3 所示。
图 1-4 Cry 毒素杀虫的作用原理Fig.1-4 The principle of Cry toxins insecticidal actionBin 毒素存在于具有较高杀蚊活性的球形芽孢杆菌（Lysinibacillus sphaericus）产生的晶体中。晶体由两个独立但同源的蛋白质 BinA（42 kDa）和 BinB（51 kDa）组成，并且在芽胞形成之初沉积在外生孢子内。异源表达的这两种蛋白都对蚊子幼虫具有毒杀作用，并且等摩尔比例混合的蛋白具有最高的活性[60-62]。重组 Bt 菌株中产生的 BinA 本身也具有毒性，B毒素在目标昆虫的中肠中被蛋白水解酶水解和激活，毒素与靶昆虫肠道上皮特异性受体结合[63-64]。报道指出克隆淡色库蚊幼虫的受体与大小 60 kDa 的 GPI 锚定膜 -葡糖苷酶结合后，上皮细胞出现各种超微结构改变，导致膜孔形成，用人造膜进行的体外测定显示，主要是蛋白质 BinA 以及 BinB 的辅助引起膜通道形成[65]。BinA 和 BinB 是高度同源的蛋白，但是在化过程中功能似乎已经发生了分歧，其中 BinA 作用于通道形成，而 BinB 作用于受体结合[66同球形芽胞杆菌产生的杀蚊毒素较为相似的还有 Mtx 毒素，Mtx 毒素以 MTX 为保守构域。Cry15，Cry23，Cry33，Cry38，Cry45 等毒素都属于含有 MTX 为保守结构域的 M毒素家族。苏云金芽胞杆菌 Cry15Aa 蛋白与 Mtx2 和 Mtx3 具有同源性，能够对鳞翅目烟草天蛾显示出毒杀活性，并且在晶体中发现分子量为 40 kDa 的蛋白，该蛋白本身并没有杀虫活性也不影响 Cry15A 对烟草天蛾的毒杀活性，但它却能大大增强对苹果蠹蛾的活性。Mtx2，Mt营养期产生毒素对致倦库蚊和埃及伊蚊表现出杀蚊活性[67-68]。Mtx2 毒素对两种蚊子的作用是不同的，研究表明 Mtx2 毒素的 224 位氨基酸是决定最佳杀虫目标的关键部位，赖氨酸在这
【参考文献】：
期刊论文
[1]聚合酶链式反应技术及应用[J]. 东锐. 绿色科技. 2018(08)
[2]抗虫转Bt基因植物的环境安全研究进展[J]. 刘标. 南京师大学报(自然科学版). 2016(03)
[3]对大黑鳃金龟甲幼虫高效的苏云金芽胞杆菌筛选及cry基因鉴定[J]. 王小奇,束长龙,蒋健,张风娇,刘春琴,张杰. 植物保护学报. 2016(03)
[4]苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白研究进展[J]. 彭琦,周子珊,张杰. 中国生物防治学报. 2015(05)
[5]Bt菌株DQ89的sip基因的克隆、表达及杀虫活性分析[J]. 张金波,李海涛,刘荣梅,束长龙,高继国. 中国生物防治学报. 2015(04)
[6]苏云金芽胞杆菌晶体蛋白2Ab32（Cry2Ab32）基因的克隆、表达与杀虫活性分析[J]. 余宗兰,黄刚辉,李巧,贺利业,龚莉,刘瑶,李平,郑爱萍. 农业生物技术学报. 2015(06)
[7]苏云金芽胞杆菌应用研究进展[J]. 刘明,李海涛,刘荣梅,高继国. 黑龙江八一农垦大学学报. 2014(04)
[8]我国生物技术育种现状与发展趋势[J]. 康乐,王海洋. 中国农业科技导报. 2014(01)
[9]Vip3A杀虫蛋白随机重组文库的构建与分析[J]. 张宁,刘荣梅,束长龙,张杰,李海涛,高继国. 生物技术通报. 2013(03)
[10]苏云金芽胞杆菌晶体毒素的多样性[J]. 赵新民,刘淑云,周攀登,徐玲,夏莉,夏立秋,成飞雪. 植物保护. 2013(01)
硕士论文
[1]Bt菌株与化学农药相容性研究[D]. 张贤.山西师范大学 2018
[2]Bt Vip3Aa11和Vip3Aa39片段置换对杀虫活性的影响[D]. 史琛琛.东北农业大学 2018
[3]黑龙江省苏云金杆菌的分离及新型cry基因的克隆与表达[D]. 徐馨竹.东北农业大学 2017
[4]对海南地区Bt菌株cry基因的鉴定、克隆及蛋白活性分析[D]. 张月.东北农业大学 2017
[5]苏云金芽胞杆菌cry1类基因鉴定、表达和活性分析[D]. 何宝楠.东北农业大学 2014
[6]苏云金芽胞杆菌新型cry1基因克隆、表达及活性分析[D]. 刘东明.东北农业大学 2011
[7]对鞘翅目害虫具有活性的新型cry基因的研究[D]. 茅洁瑜.华侨大学 2011
[8]苏云金芽胞杆菌新型vip3基因克隆、表达及活性分析[D]. 何晓明.东北农业大学 2011
[9]苏云金杆菌cry9Ea7基因的克隆与表达[D]. 孙永祥.河北农业大学 2010
[10]苏云金芽胞杆菌新型cry9基因克隆、表达及活性分析[D]. 苏慧琴.东北农业大学 2010
本文编号：3503494
【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
Cry蛋白的保守结构域[92]
引 言自 1985 年至 2018 年，经过三十几年的发掘与筛选，Cry 蛋白已经被研究者们分为 78个不同类型（Cry1 到 Cry78），包含来源于 Bt 和其他芽胞杆菌的 3D 蛋白和 ETX_MTX2 家族蛋白。Cry 类蛋白质家族可分为三种类别：3D-Cry 毒素家族、Bin 毒素家族和 Mtx 毒素家族[41-42]。3D-Cry 毒素家族是 Cry 蛋白家族中最大并且研究最为广泛的类群，在该类群的蛋白结构具有高度相似的 3D 结构。结构域 I 是七个 -螺旋簇构成，主要与细胞膜的插入，毒素的活化和孔道形成有关。结构域 II 是一个反向平行的 β 折叠片构成，平行的 β-折叠结构包裹在疏水核心周围，其暴露的环形区域则参与受体识别。结构域 III 是两个反平行的 β-折叠片，结构域 II 和 III 都是通过识别特异性受体对昆虫产生特异性反应的结构[43-48]。Domain I、Domain II 和 Domain III 的结构如图 1-3 所示。
图 1-4 Cry 毒素杀虫的作用原理Fig.1-4 The principle of Cry toxins insecticidal actionBin 毒素存在于具有较高杀蚊活性的球形芽孢杆菌（Lysinibacillus sphaericus）产生的晶体中。晶体由两个独立但同源的蛋白质 BinA（42 kDa）和 BinB（51 kDa）组成，并且在芽胞形成之初沉积在外生孢子内。异源表达的这两种蛋白都对蚊子幼虫具有毒杀作用，并且等摩尔比例混合的蛋白具有最高的活性[60-62]。重组 Bt 菌株中产生的 BinA 本身也具有毒性，B毒素在目标昆虫的中肠中被蛋白水解酶水解和激活，毒素与靶昆虫肠道上皮特异性受体结合[63-64]。报道指出克隆淡色库蚊幼虫的受体与大小 60 kDa 的 GPI 锚定膜 -葡糖苷酶结合后，上皮细胞出现各种超微结构改变，导致膜孔形成，用人造膜进行的体外测定显示，主要是蛋白质 BinA 以及 BinB 的辅助引起膜通道形成[65]。BinA 和 BinB 是高度同源的蛋白，但是在化过程中功能似乎已经发生了分歧，其中 BinA 作用于通道形成，而 BinB 作用于受体结合[66同球形芽胞杆菌产生的杀蚊毒素较为相似的还有 Mtx 毒素，Mtx 毒素以 MTX 为保守构域。Cry15，Cry23，Cry33，Cry38，Cry45 等毒素都属于含有 MTX 为保守结构域的 M毒素家族。苏云金芽胞杆菌 Cry15Aa 蛋白与 Mtx2 和 Mtx3 具有同源性，能够对鳞翅目烟草天蛾显示出毒杀活性，并且在晶体中发现分子量为 40 kDa 的蛋白，该蛋白本身并没有杀虫活性也不影响 Cry15A 对烟草天蛾的毒杀活性，但它却能大大增强对苹果蠹蛾的活性。Mtx2，Mt营养期产生毒素对致倦库蚊和埃及伊蚊表现出杀蚊活性[67-68]。Mtx2 毒素对两种蚊子的作用是不同的，研究表明 Mtx2 毒素的 224 位氨基酸是决定最佳杀虫目标的关键部位，赖氨酸在这
【参考文献】：
期刊论文
[1]聚合酶链式反应技术及应用[J]. 东锐. 绿色科技. 2018(08)
[2]抗虫转Bt基因植物的环境安全研究进展[J]. 刘标. 南京师大学报(自然科学版). 2016(03)
[3]对大黑鳃金龟甲幼虫高效的苏云金芽胞杆菌筛选及cry基因鉴定[J]. 王小奇,束长龙,蒋健,张风娇,刘春琴,张杰. 植物保护学报. 2016(03)
[4]苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白研究进展[J]. 彭琦,周子珊,张杰. 中国生物防治学报. 2015(05)
[5]Bt菌株DQ89的sip基因的克隆、表达及杀虫活性分析[J]. 张金波,李海涛,刘荣梅,束长龙,高继国. 中国生物防治学报. 2015(04)
[6]苏云金芽胞杆菌晶体蛋白2Ab32（Cry2Ab32）基因的克隆、表达与杀虫活性分析[J]. 余宗兰,黄刚辉,李巧,贺利业,龚莉,刘瑶,李平,郑爱萍. 农业生物技术学报. 2015(06)
[7]苏云金芽胞杆菌应用研究进展[J]. 刘明,李海涛,刘荣梅,高继国. 黑龙江八一农垦大学学报. 2014(04)
[8]我国生物技术育种现状与发展趋势[J]. 康乐,王海洋. 中国农业科技导报. 2014(01)
[9]Vip3A杀虫蛋白随机重组文库的构建与分析[J]. 张宁,刘荣梅,束长龙,张杰,李海涛,高继国. 生物技术通报. 2013(03)
[10]苏云金芽胞杆菌晶体毒素的多样性[J]. 赵新民,刘淑云,周攀登,徐玲,夏莉,夏立秋,成飞雪. 植物保护. 2013(01)
硕士论文
[1]Bt菌株与化学农药相容性研究[D]. 张贤.山西师范大学 2018
[2]Bt Vip3Aa11和Vip3Aa39片段置换对杀虫活性的影响[D]. 史琛琛.东北农业大学 2018
[3]黑龙江省苏云金杆菌的分离及新型cry基因的克隆与表达[D]. 徐馨竹.东北农业大学 2017
[4]对海南地区Bt菌株cry基因的鉴定、克隆及蛋白活性分析[D]. 张月.东北农业大学 2017
[5]苏云金芽胞杆菌cry1类基因鉴定、表达和活性分析[D]. 何宝楠.东北农业大学 2014
[6]苏云金芽胞杆菌新型cry1基因克隆、表达及活性分析[D]. 刘东明.东北农业大学 2011
[7]对鞘翅目害虫具有活性的新型cry基因的研究[D]. 茅洁瑜.华侨大学 2011
[8]苏云金芽胞杆菌新型vip3基因克隆、表达及活性分析[D]. 何晓明.东北农业大学 2011
[9]苏云金杆菌cry9Ea7基因的克隆与表达[D]. 孙永祥.河北农业大学 2010
[10]苏云金芽胞杆菌新型cry9基因克隆、表达及活性分析[D]. 苏慧琴.东北农业大学 2010
本文编号：3503494
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