核盘菌新病毒发现及+ssRNA病毒侵染性克隆的构建
发布时间：2022-12-25 09:48
核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）是重要的世界性病原真菌,能够引起油菜、大豆和向日葵等多种作物的菌核病,给作物生产造成巨大的经济损失。真菌病毒在核盘菌中广泛存在,具有生物防治的潜力。以四川省成都市安德镇采集的核盘菌菌核PX14为材料,通过表面消毒、切片培养,分离获得了11个菌株PX14A（1-4）、PX14B（1-6）和PX14D,发现这些菌株具有不同的菌落形态和致病力。通过对这11个菌株的总RNA进行宏病毒组测序和随机克隆,共获得12种RNA病毒（或病毒株系）和5个不编码Rd Rp的ds RNA片段全长序列。这些病毒分别属于五个不同的类群,包括属于减毒病毒科（Hypoviridae）的核盘菌减毒病毒1（Ss HV1）、属于泛欧尔密科（Botourmiaviridae）的核盘菌欧尔密样病毒4（Ss OLV4）和核盘菌欧尔密样病毒5（Ss OLV5）、属于布尼亚病毒目（Bunyavirales）的核盘菌白纤样病毒1（Ss Ph LV1）和核盘菌白纤样病毒2（Ss Ph LV2）、属于线粒体病毒科（Mitoviridae）的核盘菌线粒体病毒6-PX14病毒株（Ss ...
【文章页数】：180 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语表
第一章 文献综述
1.1 核盘菌危害与防治策略
1.1.1 核盘菌的危害
1.1.2 核盘菌的生活史和致病机理
1.1.3 菌核病的防治
1.1.3.1 抗病育种
1.1.3.2 农业措施
1.1.3.3 化学防治
1.1.3.4 生物防治
1.2 真菌病毒
1.2.1 真菌病毒的研究史
1.2.2 真菌病毒分类
1.2.2.1 病毒分类法
1.2.2.2 真菌病毒的分类进展
1.2.3 本研究涉及的RNA病毒类群
1.2.3.1 裸露病毒科和线粒体病毒科
1.2.3.2 泛欧尔密病毒科
1.2.3.3 真菌芜菁黄花叶病毒目
1.2.3.4 真菌负义链RNA病毒
1.2.4 真菌病毒的传播
1.2.4.1 垂直传播
1.2.4.2 水平传播
1.2.4.3 体外传播
1.2.4.4 介体传播
1.2.5 真菌病毒应用
1.2.5.1 真菌病毒对寄主的影响
1.2.5.2 真菌病毒应用实例
1.2.5.3 真菌病毒的应用问题
1.3 真菌病毒反向遗传学
1.3.1 反向遗传学
1.3.2 真菌病毒反向遗传学
1.4 本研究的目的和意义
第二章 菌核样本PX14病毒多样性研究
2.1 引言
2.2 试验材料
2.2.1 试验菌株
2.2.2 植物材料
2.2.3 载体和引物
2.2.4 主要试剂和培养基
2.2.5 主要仪器和设备
2.3 试验方法
2.3.1 核盘菌生物学研究
2.3.2 核盘菌dsRNA提取和处理
2.3.3 核酸电泳
2.3.4 总RNA提取
2.3.5 病毒RT-PCR验证
2.3.6 病毒RNA序列随机克隆
2.3.7 病毒末端克隆
2.3.8 序列测定
2.3.9 NGS测序过程和分析
2.3.10 序列分析和系统发育分析所用软件
2.3.11 原生质体制备和再生
2.3.12 病毒粒子提取
2.4 结果和分析
2.4.1 PX14系列分离后代的生物学特性
2.4.1.1 PX14系列菌株菌落形态和生长速度不同
2.4.1.2 PX14系列菌株的致病力具有显著差异
2.4.2 菌核样本PX14病毒多样性
2.4.2.1 病毒组测序获得的病毒序列
2.4.2.2 病毒在PX14系列菌株中的定位
2.4.2.3 菌株PX14A1和PX14A4 中存在ds RNA因子
2.4.2.4 原生质体再生脱毒菌株
2.4.3 多节段负链病毒的特性
2.4.3.1 多节段负链病毒的病毒粒子
2.4.3.2 病毒序列克隆
2.4.3.3 核盘菌白纤样病毒的基因组
2.4.3.4 系统发育分析
2.4.3.5 SsPhL V1和SsPhL V2 寄主生物学特性
2.4.3.6 小孢子观察
2.4.4 真菌芜菁黄花叶病毒
2.4.4.1 SsDFV1、SsDFV3和SsMTV2 的分子特性
2.4.4.2 SsDFV1的病毒株系分化
2.4.4.3 系统发育分析
2.4.4.4 SsDFV1寄主的生物学表型分化
2.5 结论与讨论
第三章 核盘菌欧尔密样病毒4(SsOLV4)的特性研究
3.1 引言
3.2 试验材料
3.3 试验方法
3.3.1 病毒的序列克隆和验证
3.3.2 分析软件
3.3.3 病毒SsOLV4 全长cDNA克隆构建
3.3.4 体外转录模板DNA的获得
3.3.5 SsOLV4 体外转录RNA的获得
3.3.6 病毒SsOLV4 RNA转染
3.3.7 病毒SsOLV水平传播能力测定
3.3.8 核酸杂交
3.4 结果和分析
3.4.1 原生质体再生获得无毒菌株N39和N69
3.4.2 病毒SsOLV4分子特性
3.4.3 SsOLV4系统发育分析
3.4.4 合成病毒RNA的侵染性检测
3.4.5 SsOLV4侵染性克隆的侵染
3.4.6 转染菌株中SsOLV4的Northern blot检测
3.4.7 侵染性克隆SsOLV4的传播特性
3.4.8 病毒RNA侵染菌丝
3.4.9 转染菌株中病毒序列比较
3.4.10 SsOLV4的亚细胞定位
3.4.11 SsOLV4侵染对寄主表型没有影响
3.5 结论与讨论
第四章 菌株Ep-1PN弱毒特性的研究
4.1 引言
4.2 试验材料
4.3 试验方法
4.3.1 总RNA提取和RT-PCR验证
4.3.2 NGS测序与分析软件
4.3.3 病毒序列验证
4.3.4 dsRNA提取
4.3.5 病毒全长cDNA合成
4.3.5.1 病毒SsDaRV全长cDNA构建
4.3.5.2 病毒SsNaLV1 全长cDNA构建
4.3.6 病毒RNA合成和转染
4.3.7 病毒水平传毒
4.3.8 dsRNA杂交
4.3.9 生物学表型测定
4.4 结果和分析
4.4.1 菌株Ep-1PN和 Ep-1PNA367中ds RNA和病毒鉴定
4.4.2 SsDRV的序列
4.4.3 SsNaLV1 的基因组和分类地位
4.4.4 Ep-1PN总 RNA的转染
4.4.5 病毒的杂交检测
4.4.6 SsDRV和 SsNaLV1 的侵染性克隆对核盘菌的影响
4.4.7 带毒菌株的传毒
4.4.8 SsDRV的缺陷型RNA
4.5 结论与讨论
第五章 全文总结与展望
5.1 全文总结
5.2 思考与展望
5.2.1 新的病毒类群的建立
5.2.2 真菌病毒基因组简化
5.2.3 真菌病毒的应用
参考文献
附录 Ⅰ试验所用引物
附录 Ⅱ病毒序列
附录 Ⅲ在读期间研究成果
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]布尼亚病毒目新分类概述[J]. 唐霜,沈姝,史君明,方耀辉,王华林,胡志红,邓菲. 生物多样性. 2018(09)
[2]大量诱导核盘菌产生子囊盘的方法改进(英文)[J]. 李国庆,姜道宏,孟金陵,易先宏,朱斌,RimmerSR. 华中农业大学学报. 1999(06)
[3]来源于佳木斯茄子上的核盘菌菌株多样性的研究[J]. 李国庆,王道本,黄鸿章,周启. 植物病理学报. 1996(03)
博士论文
[1]核盘菌分泌蛋白SsCP1的功能研究[D]. 羊国根.华中农业大学 2017
[2]比较基因组、转录组和基因功能研究揭示核盘菌致病和发育的分子机理[D]. 吕学良.华中农业大学 2015
[3]核盘菌新型RNA病毒研究[D]. 刘立江.华中农业大学 2015
[4]核盘菌弱毒相关DNA病毒1特性及其应用潜能研究[D]. 于晓.华中农业大学 2013
[5]真核生物非逆转录病毒内生化与进化基因组学研究[D]. 刘慧泉.华中农业大学 2011
[6]单一田块核盘菌多样性分析及携带真菌病毒的菌株的遗传特性研究[D]. 张丽艳.华中农业大学 2010
[7]核盘菌Ep-1PN菌株毒力衰退及生防潜能的研究[D]. 姜道宏.华中农业大学 1999
硕士论文
[1]核盘菌病毒SsDRV的5’末端克隆及侵染性全长cDNA克隆的构建[D]. 羊国根.华中农业大学 2009
[2]核盘菌弱毒相关RNA病毒（SsDRV）感染雪腐核盘菌的初步研究[D]. 滕飞.华中农业大学 2008
本文编号：3726379
【文章页数】：180 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语表
第一章 文献综述
1.1 核盘菌危害与防治策略
1.1.1 核盘菌的危害
1.1.2 核盘菌的生活史和致病机理
1.1.3 菌核病的防治
1.1.3.1 抗病育种
1.1.3.2 农业措施
1.1.3.3 化学防治
1.1.3.4 生物防治
1.2 真菌病毒
1.2.1 真菌病毒的研究史
1.2.2 真菌病毒分类
1.2.2.1 病毒分类法
1.2.2.2 真菌病毒的分类进展
1.2.3 本研究涉及的RNA病毒类群
1.2.3.1 裸露病毒科和线粒体病毒科
1.2.3.2 泛欧尔密病毒科
1.2.3.3 真菌芜菁黄花叶病毒目
1.2.3.4 真菌负义链RNA病毒
1.2.4 真菌病毒的传播
1.2.4.1 垂直传播
1.2.4.2 水平传播
1.2.4.3 体外传播
1.2.4.4 介体传播
1.2.5 真菌病毒应用
1.2.5.1 真菌病毒对寄主的影响
1.2.5.2 真菌病毒应用实例
1.2.5.3 真菌病毒的应用问题
1.3 真菌病毒反向遗传学
1.3.1 反向遗传学
1.3.2 真菌病毒反向遗传学
1.4 本研究的目的和意义
第二章 菌核样本PX14病毒多样性研究
2.1 引言
2.2 试验材料
2.2.1 试验菌株
2.2.2 植物材料
2.2.3 载体和引物
2.2.4 主要试剂和培养基
2.2.5 主要仪器和设备
2.3 试验方法
2.3.1 核盘菌生物学研究
2.3.2 核盘菌dsRNA提取和处理
2.3.3 核酸电泳
2.3.4 总RNA提取
2.3.5 病毒RT-PCR验证
2.3.6 病毒RNA序列随机克隆
2.3.7 病毒末端克隆
2.3.8 序列测定
2.3.9 NGS测序过程和分析
2.3.10 序列分析和系统发育分析所用软件
2.3.11 原生质体制备和再生
2.3.12 病毒粒子提取
2.4 结果和分析
2.4.1 PX14系列分离后代的生物学特性
2.4.1.1 PX14系列菌株菌落形态和生长速度不同
2.4.1.2 PX14系列菌株的致病力具有显著差异
2.4.2 菌核样本PX14病毒多样性
2.4.2.1 病毒组测序获得的病毒序列
2.4.2.2 病毒在PX14系列菌株中的定位
2.4.2.3 菌株PX14A1和PX14A4 中存在ds RNA因子
2.4.2.4 原生质体再生脱毒菌株
2.4.3 多节段负链病毒的特性
2.4.3.1 多节段负链病毒的病毒粒子
2.4.3.2 病毒序列克隆
2.4.3.3 核盘菌白纤样病毒的基因组
2.4.3.4 系统发育分析
2.4.3.5 SsPhL V1和SsPhL V2 寄主生物学特性
2.4.3.6 小孢子观察
2.4.4 真菌芜菁黄花叶病毒
2.4.4.1 SsDFV1、SsDFV3和SsMTV2 的分子特性
2.4.4.2 SsDFV1的病毒株系分化
2.4.4.3 系统发育分析
2.4.4.4 SsDFV1寄主的生物学表型分化
2.5 结论与讨论
第三章 核盘菌欧尔密样病毒4(SsOLV4)的特性研究
3.1 引言
3.2 试验材料
3.3 试验方法
3.3.1 病毒的序列克隆和验证
3.3.2 分析软件
3.3.3 病毒SsOLV4 全长cDNA克隆构建
3.3.4 体外转录模板DNA的获得
3.3.5 SsOLV4 体外转录RNA的获得
3.3.6 病毒SsOLV4 RNA转染
3.3.7 病毒SsOLV水平传播能力测定
3.3.8 核酸杂交
3.4 结果和分析
3.4.1 原生质体再生获得无毒菌株N39和N69
3.4.2 病毒SsOLV4分子特性
3.4.3 SsOLV4系统发育分析
3.4.4 合成病毒RNA的侵染性检测
3.4.5 SsOLV4侵染性克隆的侵染
3.4.6 转染菌株中SsOLV4的Northern blot检测
3.4.7 侵染性克隆SsOLV4的传播特性
3.4.8 病毒RNA侵染菌丝
3.4.9 转染菌株中病毒序列比较
3.4.10 SsOLV4的亚细胞定位
3.4.11 SsOLV4侵染对寄主表型没有影响
3.5 结论与讨论
第四章 菌株Ep-1PN弱毒特性的研究
4.1 引言
4.2 试验材料
4.3 试验方法
4.3.1 总RNA提取和RT-PCR验证
4.3.2 NGS测序与分析软件
4.3.3 病毒序列验证
4.3.4 dsRNA提取
4.3.5 病毒全长cDNA合成
4.3.5.1 病毒SsDaRV全长cDNA构建
4.3.5.2 病毒SsNaLV1 全长cDNA构建
4.3.6 病毒RNA合成和转染
4.3.7 病毒水平传毒
4.3.8 dsRNA杂交
4.3.9 生物学表型测定
4.4 结果和分析
4.4.1 菌株Ep-1PN和 Ep-1PNA367中ds RNA和病毒鉴定
4.4.2 SsDRV的序列
4.4.3 SsNaLV1 的基因组和分类地位
4.4.4 Ep-1PN总 RNA的转染
4.4.5 病毒的杂交检测
4.4.6 SsDRV和 SsNaLV1 的侵染性克隆对核盘菌的影响
4.4.7 带毒菌株的传毒
4.4.8 SsDRV的缺陷型RNA
4.5 结论与讨论
第五章 全文总结与展望
5.1 全文总结
5.2 思考与展望
5.2.1 新的病毒类群的建立
5.2.2 真菌病毒基因组简化
5.2.3 真菌病毒的应用
参考文献
附录 Ⅰ试验所用引物
附录 Ⅱ病毒序列
附录 Ⅲ在读期间研究成果
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]布尼亚病毒目新分类概述[J]. 唐霜,沈姝,史君明,方耀辉,王华林,胡志红,邓菲. 生物多样性. 2018(09)
[2]大量诱导核盘菌产生子囊盘的方法改进(英文)[J]. 李国庆,姜道宏,孟金陵,易先宏,朱斌,RimmerSR. 华中农业大学学报. 1999(06)
[3]来源于佳木斯茄子上的核盘菌菌株多样性的研究[J]. 李国庆,王道本,黄鸿章,周启. 植物病理学报. 1996(03)
博士论文
[1]核盘菌分泌蛋白SsCP1的功能研究[D]. 羊国根.华中农业大学 2017
[2]比较基因组、转录组和基因功能研究揭示核盘菌致病和发育的分子机理[D]. 吕学良.华中农业大学 2015
[3]核盘菌新型RNA病毒研究[D]. 刘立江.华中农业大学 2015
[4]核盘菌弱毒相关DNA病毒1特性及其应用潜能研究[D]. 于晓.华中农业大学 2013
[5]真核生物非逆转录病毒内生化与进化基因组学研究[D]. 刘慧泉.华中农业大学 2011
[6]单一田块核盘菌多样性分析及携带真菌病毒的菌株的遗传特性研究[D]. 张丽艳.华中农业大学 2010
[7]核盘菌Ep-1PN菌株毒力衰退及生防潜能的研究[D]. 姜道宏.华中农业大学 1999
硕士论文
[1]核盘菌病毒SsDRV的5’末端克隆及侵染性全长cDNA克隆的构建[D]. 羊国根.华中农业大学 2009
[2]核盘菌弱毒相关RNA病毒（SsDRV）感染雪腐核盘菌的初步研究[D]. 滕飞.华中农业大学 2008
本文编号：3726379
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/nykj/3726379.html
