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溴氰菊酯抗性和敏感品系小菜蛾幼虫体内差异表达蛋白的鉴定与分析

发布时间:2022-12-25 15:11
  小菜蛾Plutella xylostella L属鳞翅目菜蛾科,作为世界性分布的十字花科蔬菜主要害虫,也是抗药性产生最快和最强的农业害虫之一。自1953年小菜蛾被报道成为世界上第一个对DDT产生抗性的作物害虫以来,已对多种杀虫剂产生抗性,其中以对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性发展最快。小菜蛾抗药性的产生和不断增强带来一系列的危害,农业减产、环境污染、伤害天敌、甚至危害人类的健康和生态平衡。因此,小菜蛾抗性机理方面的研究刻不容缓。 溴氰菊酯(deltamethrin, DM)是人工合成拟除虫菊酯杀虫剂中杀虫毒力最强的品种之一,对哺乳动物安全,具有广谱、低残留的特点,在生产实践中得到了广泛应用。我们前期的研究发现,小菜蛾溴氰菊酯敏感品系和抗性品系成虫期的蛋白质双向电泳图谱存在显著差异。但是,小菜蛾的主要危害是在幼虫期,而且同一蛋白在不同生理阶段表达水平也有很大差异,因此分析幼虫在溴氰菊酯胁迫下蛋白质表达谱的变化,不仅有助于阐述抗性机理,分析交互抗性,还有望筛选出杀虫剂的分子靶标。本文在前期工作的基础上,采用双向电泳和质谱技术对小菜蛾幼虫体内差异表达的蛋白质进行分离和鉴定,通过基因转染技术进... 

【文章页数】:62 页

【学位级别】:硕士

【文章目录】:
摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
    1.1 小菜蛾抗性发展现状
    1.2 小菜蛾对农药抗性的研究
        1.2.1 有机磷类
        1.2.2 拟除虫菊酯类
        1.2.3 氨基甲酸酯类
        1.2.4 沙蚕毒素类
        1.2.5 抗生素阿维菌素类
        1.2.6 苏云金杆菌类
    1.3 小菜蛾的抗药性机制
        1.3.1 解毒酶活性增加
        1.3.2 靶标敏感度降低
    1.4 蛋白质组学研究
        1.4.1 蛋白质组学研究策略
        1.4.2 蛋白质组学技术
            1.4.2.1 蛋白质分离技术
            1.4.2.2 蛋白质鉴定技术
        1.4.3 蛋白质组学在昆虫抗药性方面的研究
    1.5 基因转染技术
第2章 小菜蛾幼虫体内差异表达蛋白的分离与鉴定
    2.1 实验材料
        2.1.1 供试小菜蛾
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 试剂配制
        2.2.2 蛋白样品制备
            2.2.2.1 小菜蛾幼虫总蛋白的提取
            2.2.2.2 蛋白标准曲线的制备和浓度检测
        2.2.3 双向电泳
            2.2.3.1 第一向等电聚焦(IEF)
            2.2.3.2 第二向SDS-PAGE电泳
        2.2.4 图像采集与分析
            2.2.4.1 银染
            2.2.4.2 凝胶扫描与图像分析
        2.2.5 质谱鉴定
            2.2.5.1 取点
            2.2.5.2 胶内酶解
            2.2.5.3 MALDI-TOF-TOF 质谱
    2.3 实验结果
        2.3.1 蛋白质样品的浓度测定
        2.3.2 小菜蛾幼虫的双向电泳图谱
        2.3.3 差异蛋白点的质谱鉴定结果
    2.4 讨论
        2.4.1 双向电泳图谱分析
        2.4.2 质谱鉴定结果分析
第3章 应用qRT-PCR技术验证小菜蛾幼虫体内差异蛋白质的表达
    3.1 实验材料
        3.1.1 供试小菜蛾
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 提取小菜蛾幼虫总RNA
        3.2.2 检测RNA的浓度和纯度
        3.2.3 合成cDNA
        3.2.4 实时荧光定量PCR
        3.2.5 数据统计与分析
    3.3 结果
        3.3.1 RNA样品的测定
        3.3.2 qRT-PCR检测结果
        3.3.3 差异点蛋白的表达分析
    3.4 讨论
第4章 TCTP过表达对Kc细胞溴氰菊酯敏感性的影响
    4.1 实验材料
        4.1.1 供试小菜蛾
        4.1.2 果蝇Kc细胞
        4.1.3 主要试剂和仪器
        4.1.4 主要仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 TCTP目的基因的制备
            4.2.1.1 提取小菜蛾幼虫总RNA
            4.2.1.2 合成cDNA
            4.2.1.3 PCR扩增目的基因片段
        4.2.2 构建重组质粒
            4.2.2.1 PCR产物纯化
            4.2.2.2 构建pIB-TCTP重组质粒
            4.2.2.3 鉴定重组质粒
        4.2.3 瞬时转染Kc细胞
            4.2.3.1 抽提质粒
            4.2.3.2 Kc细胞接种6孔板
            4.2.3.3 转染Kc细胞
        4.2.4 实时荧光定量PCR检测目的基因表达
            4.2.4.1 提取细胞RNA
            4.2.4.2 逆转录合成cDNA
            4.2.4.3 实时荧光定量PCR
        4.2.5 细胞毒性检测
    4.3 实验结果
        4.3.1 PCR扩增目的基因
        4.3.2 重组质粒pIB-TCTP的鉴定
        4.3.3 TCTP基因的表达分析
        4.3.4 细胞活力分析
    4.4 讨论
第5章 总结
参考文献
在读学位期间的研究成果及发表的学术论文
致谢


【参考文献】:
期刊论文
[1]小菜蛾溴氰菊酯敏感和抗性品系蛋白质表达谱的比较分析(英文)[J]. 张娜娜,张宏,程晨,李凤良,高少奇,程罗根.  昆虫学报. 2013(01)
[2]沈阳地区小菜蛾对五种常用杀虫剂的抗性测定[J]. 杨海霞,王欢,董辉,丛斌.  北方园艺. 2011(18)
[3]真核细胞伴侣素CCT及其与细胞骨架的关系[J]. 段芳蕾,孙兴旺,曹灵.  中国细胞生物学学报. 2011(07)
[4]溴氰菊酯抗感品系小菜蛾成虫差异表达蛋白的鉴定[J]. 程滨,张娜娜,许勤,杨小怡,程罗根,李忠英.  南京师大学报(自然科学版). 2010(02)
[5]拟除虫菊酯类农药的进展和剂型[J]. 华纯.  世界农药. 2009(05)
[6]脂肪酸结合蛋白的研究进展[J]. 蒋金津,陈立祥,邹增丁.  畜牧与饲料科学. 2009(02)
[7]农药残留及其环境污染分析研究与对策[J]. 高艳卫.  安徽农学通报. 2007(04)
[8]高温和阿维菌素对朱砂叶螨的胁迫效应及热休克蛋白研究[J]. 刘开林,何林,缪应林,张云鹏,王进军,赵志模.  中国农学通报. 2007(01)
[9]食品中有机磷农药残留的快速检测方法[J]. 于丽娜,汪东风,苏琳.  粮油食品科技. 2005(02)
[10]南京地区小菜蛾对常用杀虫剂抗药性的动态监测[J]. 许小龙,顾中言,韩丽娟.  华东昆虫学报. 2004(02)



本文编号:3726853

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