WRKY26-bHLH3共促进红皮梨花青苷合成及花青苷抑制黑曲霉侵染的分子机制研究

发布时间：2024-11-06 21:31

　　黑曲霉(Aspergillus niger)是一类常见的曲霉属真菌,作为一种典型的植物病原微生物,它普遍存在于各种粮食产品、园艺果蔬以及土壤里,可直接导致食物、谷物和果蔬的霉腐变质,每年对世界各国造成难以估量的经济损失。关于黑曲霉的致病机理及防治策略也一直是科研工作者们持续探寻的问题。而近些年,关于花青苷在抑制病原微生物方面的作用逐渐引起人们的关注,花青苷是植物中常见的次生代谢物,具有很强的抗氧化能力,与植物的抗逆及各项生理活动息息相关,并且对人类的健康也有着诸多益处;已经有相关研究报道证明了花青素可以有效抵抗一些病原微生物的侵害,然而,花青苷能否抑制黑曲霉及其机制,尚不清楚。因此本文探究了红皮梨中花青素对黑曲霉侵染的抑制作用,并进一步揭示了 WRKY家族转录因子调控红皮梨果皮中花青苷合成的分子机制。具体内容如下:鉴于黑曲霉是导致水果腐烂的一类主要病原微生物,本文使用了本试验室保存的野生型黑曲霉菌株及其基因缺失突变体(包括ΔcatA、ΔcpefB、ΔsodC,而catA cpeB和sodC基因已被证实与黑曲霉的抗氧化代谢相关,直接影响黑曲霉的致病力)在梨果实中进行了接种试验,发现在花青苷...

【文章页数】：90 页

【学位级别】：硕士

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致谢
摘要
ABSTRACT
第一章: 引言
    1.1. 植物真菌病害研究概述
        1.1.1 病原微生物对植物的侵害
        1.1.2 国内植物真菌病害研究现状
        1.1.3 黑曲霉概述
    1.2. 植物的免疫防御及抗病机制
    1.3 花青苷概述
    1.4 花青苷生物合成和转运的分子机制
        1.4.1. 花青苷生物合成的途径
        1.4.2 参与花青苷生物合成的相关转录因子
        1.4.3 花青苷的转运与储存
    1.5 课题研究的目的、意义及内容
        1.5.1 课题研究的目的和意义
        1.5.2 课题研究的主要内容
第二章: 梨果皮中花青苷的抑菌研究
    2.1 试验材料、试剂及仪器
        2.1.1 试验材料
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器设备
    2.2 试验方法
        2.2.1 不同品种梨果皮花青苷的提取与测定
        2.2.2 水浸提取法提取梨果皮花青苷
        2.2.3 大肠杆菌和黑曲霉的菌悬液配制
        2.2.4 抑菌率—平板菌落计数法
        2.2.5 不同品种梨果实抗侵染能力的检测
        2.2.6 梨果皮侵染部位总RNA的提取及反转录
        2.2.7 RT-qPCR分析侵染后梨果实花青苷相关关键基因的表达量
    2.3 结果与分析
        2.3.1 不同品种间梨果皮花青苷含量测定结果分析
        2.3.2 红茄梨果皮中花青苷的提取
        2.3.3 梨果皮中花青苷的体外平板抑菌试验
        2.3.4 不同品种间梨果实抗侵染能力的分析
        2.3.5 侵染后梨果皮中花青苷合成相关基因的表达量分析
    2.4 本章小结
第三章: 花青苷合成关键转录因子的功能验证
    3.1 试验材料、试剂及仪器
        3.1.1 试验材料
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要仪器设备
    3.2 试验方法
        3.2.1 WRKYs转录因子的生物信息学分析
        3.2.2 不同品种的梨果皮中花青苷的提取及含量测定
        3.2.3 梨果皮中总RNA的提取及反转录
        3.2.4 不同品种的梨果皮中花青苷生物合成转运相关基因表达量分析及其与花青苷含量相关性分析
        3.2.5 用于验证基因功能的植物材料的培养
        3.2.6 PyWRKY26和PyWRKY31等关键基因的瞬时表达载体构建及菌株转化
        3.2.7 烟草叶片和草莓果实的瞬时转化试验
        3.2.8 烟草叶片与草莓果实的色差分析
    3.3 结果与分析
        3.3.1 通过转录组数据和生物信息学分析筛选候选WRKY基因
        3.3.2 验证梨中青苷合成相关转录因子与花青苷积累的相关性
        3.3.3 PyWRKY26和PyWRKY31基因的克隆及pSAK277载体的双酶切
        3.3.4 PyWRKY26和PyWRKY31基因瞬时表达载体的菌落鉴定及菌株转化
        3.3.5 PyWRKY26/PyWRKY31等花青苷合成相关转录因子诱导花青苷在烟叶中的积累
        3.3.6 PyWRKY26/PyWRKY31等花青苷合成相关转录因子诱导花青苷在草莓中的积累
    3.4 本章小结
第四章 PyWRKY26调节花青苷生物合成的分子机制
    4.1 试验材料、试剂及仪器
        4.1.1 试验材料
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 主要仪器设备
    4.2 试验方法
        4.2.1 用于基因功能分析的植物材料的培养
        4.2.2 草莓果实中总RNA的提取及反转录合成cDNA
        4.2.3 荧光定量PCR反应及引物的设计
        4.2.4 梨果实基因组DNA的提取
        4.2.5 双荧光素酶报告系统测定烟草叶片验证转录因子激活效应
        4.2.6 酵母单杂交系统分析
        4.2.7 荧光素酶互补试验分析
        4.2.8 酵母双杂交系统分析
    4.3 结果与分析
        4.3.1 荧光定量分析草莓果实中花青苷合成及转运基因的表达量
        4.3.2 双荧光素酶报告系统验证转录调控复合物的相互作用
        4.3.3 验证PyWRKY26和PybHLH3对PyMYB114启动子的激活活性
        4.3.4 通过酵母单杂交系统确认PyMYB114启动子的靶向基因
        4.3.5 荧光素酶互补试验验证转录因子PybHLH3与PyWRKY26的相互作用
        4.3.6 通过酵母双杂交系统验证PybHLH3与PyWRKY26的相互作用
    4.4 本章小结
第五章 结论与展望
参考文献
攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况



本文编号：4011612