苎麻谷氨酰胺合成酶基因的克隆和超量表达研究

发布时间：2017-10-18 14:46

  本文关键词：苎麻谷氨酰胺合成酶基因的克隆和超量表达研究

  更多相关文章： 苎麻 GS基因克隆 表达模式 转基因 超量表达 氮代谢

【摘要】：氮素是植物生长发育所必需的矿质营养元素，直接影响着植物的生长和发育，决定着作物产量的高低和品质的优劣。谷氨酰胺合成酶（GS）作为高等植物氮代谢途径中氮素初始同化中的关键酶，是一切无机氮素进入高等植物体内的“门户”，影响着植物氮素营养的吸收、同化及利用效率，对作物的生长发育，及产量、品质等农艺性状具有决定性作用。高等植物中谷氨酰胺合成酶分为胞液型（GS1）和质体型（GS2）两类：GS2主要同化NO-3还原而来及光呼吸过程所释放的氨；GS1主要同化从土壤吸收的和由NO-3还原而来的氨，及再同化从植物体内各个氮循环途径所释放的氨。苎麻（Boehmeria nivea L.）作为古老的纤维作物，近年来因其叶片中蛋白质及必须氨基酸含量较高、嫩茎叶营养价值与苜蓿相近、营养结构合理、年生物产量大等，被作为植物蛋白饲料原料而大量利用；同时，苎麻具有植株生长速度快、对氮素需求量大等特点。但是，国内外与苎麻氮代谢及生长特性相关的研究几乎为零，也没有进行苎麻氮代谢途径中功能基因的发掘，相关功能的研究和利用，从而阻碍了研究者对苎麻饲用及生长特性在本质上的了解，同时，也不利于苎麻中优良功能基因的发掘和利用。因此，本文以植物氮代谢途径中关键基因GS为研究对象，首次从苎麻中克隆获得GS基因家族中的4个基因，并利用生物信息学对苎麻BnGS基因序列和结构进行了分析，利用实时荧光定量PCR技术，分析了苎麻GS基因在不同组织和发育阶段的表达模式，同时，利用ClustalW和MEGA软件对GS基因进行序列比对和系统进化分析；另一方面，本文利用同源重组技术，构建了苎麻BnGS1-2基因的超量植物表达载体，并利用农杆菌侵染烟草叶片，成功获得转基因烟草植株，同时，研究了超量表达苎麻BnGS1-2基因后，转基因烟草植株对氮素的同化和利用效率，为了解苎麻GS基因的功能，及利用苎麻BnGS基因改良植物氮素利用效率和农艺性状的研究提供新的基因资源。本文主要研究结果如下： （1）首次从苎麻栽培品种“中苎1号”中克隆获得苎麻GS基因家族中的4个基因，其中两个属于胞液型GS，命名为BnGS1-1和BnGS1-2；另外两个为质体型GS基因，命名为BnGS2-1和BnGS2-2，同时选取9株“中苎1号”自交后代，利用内切酶TaqⅠ酶切位点对两个质体型BnGS2基因进行TaqⅠ酶酶切鉴定，结果表明BnGS2-1和BnGS2-2为一对等位基因。 （2）利用生物信息学对苎麻GS基因序列和结构特征进行分析，结果表明BnGS1-1基因序列全长1205bp，含一个1071bp的开放阅读框（ORF），编码356个氨基酸残基多肽；BnGS1-2基因序列全长1222bp，起始密码子位于第123-125bp，终止密码子位于1102-1104bp，编码356个氨基酸残基多肽；两个BnGS2等位基因序列全长1340bp，含一个1293bp的ORF区，编码430个氨基酸残基多肽；通过序列比对发现BnGS2等位基因ORF区11个位点核苷酸存在差异，导致编码的多肽在195、382两个位点上的氨基酸存在替换现象；苎麻BnGS基因家族编码的多肽序列含有beta-Grasp和catalytic两个保守功能域，均属于Gln-synt结构域，同时，BnGS2基因编码的多肽序列含有一段信号肽；所克隆的苎麻BnGS基因家族编码的多肽序列在56、92、249和297位点上的氨基酸残基分别为天冬氨酸、半胱氨酸、组氨酸和谷氨酸，苎麻BnGS2等位基因在306和371两个位点上都为半胱氨酸残基。 （3）利用EMBOSS和MEGA软件对苎麻BnGS基因家族进行序列比对和系统进化分析，发现苎麻BnGS基因在蛋白质序列上的相似性为77.25-91.57%，在核苷酸序列上的相似性为71.15-79.37%，并且BnGS1两个基因之内要比BnGS1与BnGS2之间的相似性高。通过对苎麻和其它物种GS基因系统进化分析表明，BnGS1-2基因在进化上起源于双子叶植物，而BnGS1-1基因却被聚类在单子叶植物分支上，同时，苎麻BnGS1-2和BnGS2与苜蓿（Medicago sativa），大豆（Glycine max）和豌豆（Phaseolus vulgaris）等具有较近的亲缘关系。 （4）利用实时荧光定量PCR分析苎麻BnGS基因在不同部位和发育阶段的表达模式，结果表明BnGS1-1、BnGS1-2和BnGS2在苎麻叶片、茎、根、韧皮部及木质部中都有表达，但在不同的部位不同的BnGS基因的表达水平却呈现明显的差异。BnGS2基因主要的表达部位为叶片，同时，随着发育阶段的不同，相对表达量也呈现明显的不一样，表达量最高的时期为出苗期和纤维发育期；BnGS1-1基因在叶子、根和韧皮部中的相对表达量明显比茎及木质部高，但是在成熟阶段叶片中BnGS1-1的mRNA水平呈显著下降；韧皮部、木质部和茎中的BnGS1-2基因，在纤维发育时期被大量的诱导，表明苎麻BnGS1-2基因可能在纤维的发育过程中起着关键的作用。另一方面，BnGS1-1和BnGS1-2基因在苎麻整个生长过程中，在根部的表达量都呈现较高的水平。因此，苎麻不同的BnGS基因通过在特定部位表达量水平的调节，从而调控苎麻生长发育过程中对氮素营养的需要。 （5）本文利用同源重组技术将苎麻BnGS1-2基因转入pBI121植物表达载体特定位点，构建了能超量表达BnGS1-2基因的植物表达载体。在农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404的介导下，通过叶盘法将构建的超量表达载体转入烟草中。通过Kana筛选和基因组DNA PCR验证，获得转基因烟草植株。利用Q-PCR对转基因植株T1进行分析，结果显示BnGS1-2在转基因植株中检测到表达，转基因烟草中GS酶活性是野生型的1-2倍。超量表达BnGS1-2基因能显著增加转基因烟草植株的株高、鲜重和叶面积，因此，超量表达BnGS1-2基因能促进烟草植株的生长；另一方面，转基因植株体内水溶性蛋白与野生型烟草相比呈现极显著性升高，增长率达92.02%，总氮含量有所提高，但并没有达到显著性水平，，同时，转基因植株体内游离NH+4含量显著下降，而游离NO-3含量与野生型相一致，因此，超量表达BnGS1-2基因，能够促进转基因烟草植株对氮素的吸收和利用，提高氮代谢效率，从而能够保证植株快速生长对氮素营养的需求。总之，本研究为苎麻GS基因功能的研究和应用提供一个理论和物质基础。
【关键词】：苎麻 GS基因克隆 表达模式 转基因 超量表达 氮代谢
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：S563.1
【目录】：

• 博士学位论文评阅人、答辩委员会签名表3-6
• 摘要6-8
• Abstract8-17
• 附图索引17-18
• 附表索引18-19
• 英文缩略表19-20
• 第一章 绪论20-32
• 1.1 植物体内氮的营养特征20-22
• 1.1.1 氮的生物学功能20
• 1.1.2 植物对氮的吸收和利用20-22
• 1.2 植物谷氨酰胺合成酶研究现状22-24
• 1.2.1 谷氨酰胺合成酶的类型22
• 1.2.2 谷氨酰胺合成酶的功能22-24
• 1.3 植物对氮素的利用效率24-27
• 1.3.1 硝酸的还原24-25
• 1.3.2 氨的同化25-26
• 1.3.3 氨基基团的相互转化26-27
• 1.4 实时荧光定量 PCR 技术27-29
• 1.4.1 基本原理和过程27
• 1.4.2 主要类型27-28
• 1.4.3 荧光定量的方法28
• 1.4.4 内参基因的选择28-29
• 1.5 苎麻概论29-30
• 1.5.1 苎麻基本概论29
• 1.5.2 苎麻饲用特性29-30
• 1.5.3 苎麻生长特点30
• 1.5.4 苎麻育种目标30
• 1.6 研究目的和意义30-32
• 第二章 苎麻谷氨酰胺合成酶（GS）基因家族的克隆、序列和系统进化分析32-47
• 2.1 材料和方法32-37
• 2.1.1 试验材料32
• 2.1.2 仪器和试剂32
• 2.1.3 RNA 提取和 cDNA 合成32-33
• 2.1.4 GS 基因家族 PCR 扩增33-34
• 2.1.5 目的片段回收34-35
• 2.1.6 目的片段与载体连接35
• 2.1.7 目的片段转化35
• 2.1.8 目的片段序列测定35-36
• 2.1.9 BnGS2 等位基因的鉴定36
• 2.1.10 BnGS 基因家族序列分析36
• 2.1.11 BnGS 基因家族进化分析36-37
• 2.2 试验结果37-45
• 2.2.1 苎麻 RNA 的提取37
• 2.2.2 苎麻 GS 基因家族克隆37-38
• 2.2.3 BnGS2 等位基因鉴定38-39
• 2.2.4 BnGS2 等位基因序列比对39-40
• 2.2.5 BnGS 基因家族序列分析40-43
• 2.2.6 BnGS 基因系统进化分析43-45
• 2.3 讨论45-47
• 2.3.1 BnGS 基因家族序列特征45
• 2.3.2 BnGS 基因系统进化45
• 2.3.3 苎麻和豆科 GS 基因的关系45-46
• 2.3.4 BnGS2 等位基因的应用46-47
• 第三章 苎麻 GS 基因家族在不同部位和发育阶段的表达分析47-63
• 3.1 材料和方法47-52
• 3.1.1 试验材料47
• 3.1.2 仪器和试剂47
• 3.1.3 样品采集47
• 3.1.4 苎麻 RNA 提取47
• 3.1.5 cDNA 合成47-48
• 3.1.6 BnGS 基因 Q-PCR 引物筛选48-49
• 3.1.7 BnGS 基因 PCR 扩增49-50
• 3.1.8 BnGS 基因表达模式分析50
• 3.1.9 BnGS 和内参基因标准曲线制备50-52
• 3.1.10 数据分析52
• 3.2 试验结果52-60
• 3.2.1 不同部位 RNA 的提取52-53
• 3.2.2 BnGS 基因 Q-PCR 引物筛选53
• 3.2.3 BnGS 基因 PCR 扩增53-54
• 3.2.4 内参基因 PCR 扩增54-55
• 3.2.5 BnGS 和内参基因标准曲线55-57
• 3.2.6 BnGS 和内参基因熔解曲线57-59
• 3.2.7 BnGS 基因不同部位和发育阶段表达模式59-60
• 3.3 讨论60-63
• 3.3.1 荧光定量 PCR 的优点60-61
• 3.3.2 荧光定量 PCR 对引物的要求61
• 3.3.3 BnGS 基因家族的表达模式及功能分析61-63
• 第四章 苎麻 BnGS1-2 基因超量表达载体的构建和转基因烟草植株的获取63-82
• 4.1 材料和方法63-71
• 4.1.1 试验材料63
• 4.1.2 仪器和试剂63
• 4.1.3 试剂的配制63-64
• 4.1.4 培养基的配制64-65
• 4.1.5 RNA 提取和 cDNA 合成65
• 4.1.6 pBI121 载体提取65-66
• 4.1.7 pBI121 载体线性化66
• 4.1.8 BnGS1-2 基因 PCR 扩增66
• 4.1.9 扩增产物纯化66
• 4.1.10 BnGS1-2 基因与载体重组连接66-67
• 4.1.11 重组载体的转化67
• 4.1.12 超量表达载体的提取67
• 4.1.13 超量表达载体的检测67
• 4.1.14 农杆菌感受态细胞的制备67-68
• 4.1.15 超量表达载体转化农杆菌68
• 4.1.16 烟草苗的培养68
• 4.1.17 农杆菌介导烟草遗传转化68-69
• 4.1.18 转基因植株 PCR 检测69-70
• 4.1.19 烟草 RNA 的提取70-71
• 4.1.20 转基因植株 Q-PCR 检测71
• 4.2 试验结果71-80
• 4.2.1 RNA 的提取71-72
• 4.2.2 pBI121 载体的提取72
• 4.2.3 BnGS1-2 基因 PCR 扩增72-73
• 4.2.4 超量表达载体的构建73-76
• 4.2.5 超量表达载体转化农杆菌76
• 4.2.6 烟草叶片转化植株再生76-77
• 4.2.7 烟草 DNA 的提取77-78
• 4.2.8 抗性植株 PCR 检测78-79
• 4.2.9 转基因植株 Q-PCR 检测79-80
• 4.3 讨论80-82
• 4.3.1 GS 基因超量表达载体构建的应用80
• 4.3.2 BnGS 基因超量表达载体的应用80-81
• 4.3.3 同源重组技术的优点81
• 4.3.4 转基因烟草植株的应用81-82
• 第五章 超量表达 BnGS1-2 基因对转基因烟草氮代谢的影响82-93
• 5.1 材料和方法82-86
• 5.1.1 试验材料82
• 5.1.2 仪器和试剂82
• 5.1.3 试剂的配制82-83
• 5.1.4 株高、鲜重及叶片数测定83
• 5.1.5 水溶性蛋白含量的测定83
• 5.1.6 游离 NH_4~+含量的测定83
• 5.1.7 游离 NO_3~-含量测定83-84
• 5.1.8 总氮含量的测定84
• 5.1.9 叶绿素含量的测定84
• 5.1.10 GS 活性的测定84
• 5.1.11 牛血清白蛋白标准曲线的制备84-85
• 5.1.12 游离 NH_4~+标准曲线的制备85
• 5.1.13 游离 NO_3~-标准曲线的制备85-86
• 5.1.14 数据分析86
• 5.2 试验结果86-91
• 5.2.1 株高、鲜重及叶片数86-87
• 5.2.2 游离 NO_3~-的含量87
• 5.2.3 游离 NH_4~+的含量87-88
• 5.2.4 总氮含量88-89
• 5.2.5 水溶性蛋白含量89
• 5.2.6 叶绿素含量89-90
• 5.2.7 GS 酶活性90
• 5.2.8 游离 NH_4~+、NO_3~-和 BAS 标准曲线90-91
• 5.3 讨论91-93
• 5.3.1 BnGS 基因功能分析91-92
• 5.3.2 超量表达 BnGS1-2 基因烟草生长特性92
• 5.3.3 超量表达 BnGS1-2 基因烟草代谢特征92-93
• 第六章 结论93-96
• 6.1 主要研究结果93-94
• 6.2 主要创新点94
• 6.3 今后研究的方向和目标94-96
• 参考文献96-106
• 致谢106-107
• 作者简历107-108

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：1055521