豌豆镁离子螯合酶Ⅰ亚基与硫氧还蛋白f的功能研究

发布时间：2016-10-09 08:38

  本文关键词：绿豆幼苗发育初期叶绿素生物合成的研究，由笔耕文化传播整理发布。

《华中农业大学》 2011年

豌豆镁离子螯合酶Ⅰ亚基与硫氧还蛋白f的功能研究

余静  

【摘要】：镁离子螯合酶是叶绿素生物合成途径(镁分支)中的第一个酶,它催化镁离子螯合到原卟啉IX中形成镁原卟啉IX,对叶绿素的生物合成起到关键性的调控作用。镁离子螯合酶由三个亚基组成,分别为I亚基,D亚基和H亚基。这些亚基除了相互作用形成镁离子螯合酶复合物行使功能以外,还参与其他的代谢途径；同时也存在一些辅助蛋白与这些亚基相互作用,从而来影响镁离子螯合酶的活性,继而控制叶绿素的合成。镁离子螯合酶的一个重要的辅助蛋白是GUN4蛋白,它与H亚基相互作用,并且可以结合镁离子螯合酶的底物,从而促进镁离子螯合酶的活性。最近日本一个研究小组发现,在拟兰芥中,硫氧还蛋白可以调控镁离子螯合酶I亚基的氧化还原状态,从而影响其ATP酶活性。 为了利用豌豆体系在叶绿体研究中的便利研究硫氧还蛋白对镁离子螯合酶I亚基的调控作用,首先,我们将NCBI数据库中I亚基已有序列进行氨基酸序列比对,选择完全同源的氨基酸序列设计兼并引物,用PCR得到豌豆中一段I亚基的cDNA序列,根据此cDNA设计基因特异性引物,用PCR的方法筛选豌豆叶片λgt11全长cDNA文库并通过5'RACE的方法,得到豌豆I亚基基因的全长cDNA,该cDNA长度为1452bp,具有一个1266bp的完整开放阅读框,可编码422个氨基酸,该蛋白理论分子质量约为45.98 KD,等电点约为5.43。然后,通过在大肠杆菌中表达外源重组的豌豆镁离子螯合酶I亚基和硫氧还蛋白f,经过镍离子亲和层析,我们获得了I亚基和硫氧还蛋白f外源重组蛋白。体外生化实验结果表明,豌豆硫氧还蛋白f能够还原镁离子螯合酶I亚基使其处于还原状态,从而激活I亚基的ATP酶活性和镁离子螯合酶活性。 为进一步研究硫氧还蛋白f对镁离子螯合酶的调控机理,我们利用酵母点对点实验研究硫氧还蛋白f与镁离子螯合酶各个亚基以及GUN4蛋白的相互作用情况,结果表明在酵母中硫氧还蛋白f只与I亚基有相互作用,与其它亚基和GUN4蛋白没有相互作用。最后,我们利用病毒介导的基因沉默(virus induced gene silencing)技术,分别获得I亚基和硫氧还蛋白f基因沉默的豌豆植株。I亚基基因沉默植株中的叶片,茎,花萼和种皮都出现黄化的表型,叶片中叶绿素和类胡萝卜素含量下降以及镁离子螯合酶活性几乎检测不到,硫氧还蛋白f基因RNA水平表达量下降。但是硫氧还蛋白f基因沉默植株没有明显表型,叶绿素和类胡萝卜素含量以及镁离子螯合酶活性都不变,而且I亚基基因RNA水平表达量不变。所有的这些实验结果,都将加深我们对硫氧还蛋白f和I亚基的了解。

【关键词】：
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：Q946
【目录】：

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