月季耐热相关蛋白编码基因的克隆与功能鉴定

发布时间：2020-12-12 15:10

　　植物固定生长,持续面对多种非生物胁迫,制约着植物的生长、发育和产量。月季（Rosa chinensis）为蔷薇属植物,是世界上重要的观赏和园艺花卉。除了商业价值,还有一定的药用价值。但是,非生物胁迫例如高温、干旱等会严重影响月季的生长发育。高温下,月季进入休眠状态,不能开花,降低其观赏价值。在全球“温室效应”日益明显的今天,如何提高月季对高温等非生物胁迫的抗性的研究将具有重要意义。为了从月季中克隆高温胁迫相关的基因,本实验室将两个耐热性不同的月季品种,耐热的“曼海姆宫殿”（SM）和不耐热的“新十全”（KP）,在380C处理3h。处理前后取材,进行双向电泳。挑选了3个在热激后的SM中高表达的蛋白,经肽质谱分析,初步推定这三个蛋白是热激蛋白、真核转录起始因子5A和胚胎发育后期丰富蛋白（late embryogenesis abundant protein, LEA）。本文通过同源克隆、反式PCR、3’-RACE从月季中克隆到了LEA基因的开放阅读框,序列比对发现该基因属于D95/Lea14类LEA蛋白基因,命名为RcLEA。亲水性分析显示,RcLEA蛋白不是典型的高亲水性LEA蛋白。亚细胞... 

【文章来源】：复旦大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：147 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
第一章 月季RcLEA基因的克隆和功能研究
    1 植物胚胎发育后期丰富蛋白的研究进展和月季抗性研究现状与意义
        1.1 植物胚胎发育后期丰富蛋白的研究进展
            1.1.1 LEA蛋白的分类
            1.1.2 LEA蛋白的序列特征
            1.1.3 LEA蛋白的结构
            1.1.4 LEA蛋白结合离子的特性和磷酸化
            1.1.5 LEA蛋白的表达模式和亚细胞定位
            1.1.6 LEA蛋白的功能
        1.2 月季的研究状况及其抗性研究意义
            1.2.1 月季介绍
            1.2.2 月季抗性研究意义
            1.2.3 月季的研究状况
        1.3 RcLEA的研究基础
    研究技术路线
    2 材料与方法
        2.1 材料
            2.1.1 月季
            2.1.2 拟南芥
            2.1.3 烟草
            2.1.4 菌株和载体
            2.1.5 试剂和仪器
        2.2 方法
            2.2.1 月季RcLEA基因克隆
            2.2.2 RcLEA蛋白氨基酸序列比对和聚类分析
            2.2.3 月季RcLEA基因的高温诱导表达模式
            2.2.4 过表达RcLEA基因大肠杆菌的胁迫评价
            2.2.5 转基因拟南芥综合评价
            2.2.6 RcLEA原核表达和纯化
            2.2.7 RcLEA对蛋白和酶活的保护
            2.2.8 亚细胞定位
            2.2.9 双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation,BiFC）实验
    3 结果与讨论
        3.1 RcLEA的克隆和序列分析
        3.2 RcLEA的亚细胞定位
        3.3 RcLEA的表达在耐热月季品种SM中受到高温诱导
        3.4 在大肠杆菌中表达RcLEA能够提高大肠杆菌对高低温、盐和氧化胁迫的耐受性
        3.5 拟南芥中过表达RcLEA增强了拟南芥对高温的抗性
        3.6 拟南芥中过表达RcLEA增强了拟南芥对低温的抗性
        3.7 拟南芥中过表达RcLEA对拟南芥的盐胁迫、渗透胁迫的耐受性没有影响
        3.8 在体外,RcLEA可以在多种胁迫下保护LDH的活性,防止CS聚合,维持大肠杆菌蛋白组的稳定
        3.9 RcLEA自身能够相互作用,以同源二聚体或寡聚体形式起作用
    4 小结
    参考文献
第二章 月季小分子热激蛋白RcHsp17.8启动子在拟南芥中的表达分析
    1 植物热激蛋白研究现状
        1.1 HSPs的分类和分子伴侣的功能
        1.2 植物sHSP的研究进展
            1.2.1 sHSP的结构与分子伴侣功能
            1.2.2 植物sHSP的分类和结构特性
            1.2.3 植物sHSP的表达模式与功能
        1.3 植物sHSP的表达调控
        1.4 RcHsp17.8研究基础与意义
    研究技术路线
    2 材料与方法
        2.1 材料
            2.1.1 拟南芥
            2.1.2 菌株和载体
            2.1.3 试剂和仪器
        2.2 方法
            2.2.1 RcHsp7.8启动子序列分析
            2.2.2 载体构建
            2.2.3 拟南芥转基因及阳性植株筛选
            2.2.4 提取转基因拟南芥DNA及PCR鉴定阳性植株
            2.2.5 RcHsp17.8全长启动子在不同发育阶段的不同组织中的热激表达
            2.2.6 RcHsp17.8全长启动子在不同胁迫下的表达
            2.2.7 RcHsp17.8启动子缺失片段在高温胁迫下的表达
            2.2.8 GUS染色
    3 结果与讨论
        3.1 RcHsp17.8启动子顺式作用元件分析
        3.2 构建表达载体
        3.3 不同发育阶段不同组织中RcHsp17.8启动子的表达
        3.4 RcHsp17.8启动子对其他非生物胁迫的响应
        3.5 RcHsp17.8启动子的缺失分析
    4 小结
    参考文献
第三章 GIGANTEA参与非生物胁迫响应的调控机理
    1 GIGANTEA（GI）功能的研究进展
        1.1 GI与开花时间调控
        1.2 GI与生物钟调控
        1.3 GI与非生物胁迫
        1.4 GI与胁迫下的开花
        1.5 Gl的其他功能
        1.6 GI与胁迫耐受性研究的意义
    研究技术路线
    2 材料与方法
        2.1 材料
            2.1.1 拟南芥
            2.1.2 菌株和载体
            2.1.3 试剂和仪器
        2.2 方法
            2.2.1 gi、wrky44突变体胁迫处理
            2.2.2 定量PCR检测胁迫相关基因表达
            2.2.3 GI-GR诱导体系建立和应用
            2.2.4 ChIP实验
            2.2.5 SOS1活性测定
    3 结果与讨论
        3.1 gi-4突变体对多种非生物胁迫敏感且与光周期无关
        3.2 DGE数据分析
        3.3 胁迫相关基因在gi-4中的表达
        3.4 AtWRKY44可能是GI的直接下游基因
        3.5 WRKY44参与盐胁迫响应
        3.6 gi-4中SOSI活性下降
    4 小结
    参考文献
发表论文及专利申请
致谢



本文编号：2912798