卵母细胞体外成熟过程中卵丘细胞上基因表达谱变化及其生物学意义

发布时间：2017-04-24 07:01

  本文关键词：卵母细胞体外成熟过程中卵丘细胞上基因表达谱变化及其生物学意义，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：卵泡作为卵巢的功能单位,由卵母细胞及包裹于其周围的颗粒细胞(granulosa cells,GCs)和外围的膜细胞组成。卵泡生长发育是一个复杂而又精细调控的过程,期间卵母细胞逐步获得发育潜能,为后续受精及胚胎发育做准备。卵泡发育过程中,随着卵泡腔形成,颗粒细胞分化为两种不同表型:①壁颗粒细胞(Mural granulose cells,MGCs),位于卵泡腔周围,主要功能为类固醇激素合成及促进卵泡壁破裂;②卵丘细胞(cumulus cells,CCs),与卵母细胞紧密联系,两者构成卵母细胞-卵丘细胞复合体(COC)。卵母细胞和CCs之间通过缝隙链接和旁分泌信号通路相互交流,形成卵母细胞生长发育的微环境,并贯穿于整个卵泡发育过程。在窦前卵泡阶段,卵泡生长不依赖于FSH的作用,主要通过GCs上表达KIT配体(KITL),作用于卵母细胞上的受体KIT促进卵子生长;反过来,卵子通过旁分泌因子(oocyte secrete factors,OSFs),主要为生长分化因子9(GDF9)和骨形态形成蛋白15(BMP15),作用于CCs促进CCs增殖、抗凋亡。在窦卵泡阶段,CCs通过缝隙连接向卵子传递c AMP和c GMP等小分子物质以维持卵母细胞减数分裂阻滞,同时其自身也受到OSFs的调节以拮抗FSH引起的黄素化作用;在卵母细胞成熟阶段,卵母细胞和CCs相互协调完成卵丘扩张及卵母细胞减数分裂恢复。此外,CCs为卵母细胞提供必须的代谢小分子如丙酮酸、丙氨酸和胆固醇以供卵母细胞生长发育,同时卵母细胞促进了CCs三大代谢相关酶的表达。卵母细胞-卵丘细胞这些紧密的相互作用,提示卵母细胞成熟过程中在CCs上存在诸多印记,即CCs上的相关基因表达、分子和信号可以间接反应卵母细胞发育成熟的状态。卵母细胞体外成熟技术(IVM)指将未成熟卵丘卵母细胞复合体(GV-COCs)从窦卵泡中取出,在特定的体外培养体系中培养成熟(MII-COCs)。IVM作为一项辅助生殖前沿技术,尤其适用于卵巢过度刺激综合征(OHSS)患者及多囊卵巢综合征(PCOS)患者。此外,近年来也有学者提出,在一些激素敏感性肿瘤患者治疗前可应用IVM对其行生育力保存。但是大量的临床数据表明,和体内成熟卵子相比,IVM后的卵子发育潜能低,因此,IVM尚未广泛应用于临床。探索IVM过程中卵丘细胞的状态及相关基因表达有助于深入理解卵母细胞成熟机制并有望改进IVM培养体系。小鼠COC体外培养和IVM,是此类研究的最常用模型。近年来,随着高通量技术的发展,检测GCs或CCs上基因表达谱成为可能。已见研究应用基因芯片技术及q-PCR技术尝试分析CCs与卵母细胞质量相关的生物标记物;也有研究应用基因芯片技术确定了不同培养条件下CCs上的基因表达谱差异。然而,鲜有关于IVM过程中CCs上基因表达谱变化的研究。因此,我们认为,基于卵母细胞和卵丘细胞之间的相互交流理论,IVM过程中CCs上的基因表达谱发生一系列的变化,通过高通量技术可以获得表达谱的变化,可望从中筛选出某些因子作为生物标记物间接评价卵母细胞发育潜能。为了验证以上科研假说,深入理解卵母细胞与CCs之间的相互交流及卵母细胞成熟的分子机制,本研究以小鼠IVM及IVF为模型,应用高通量技术研究CCs上基因表达谱特征,确定CCs上卵母细胞胞核及胞质发育潜能相关生物标记物,以期无创性评价卵母细胞质量。作为该研究的一部分,本文应用小鼠IVM模型通过基因芯片技术建立IVM前后CCs上基因表达谱的变化,进一步通过细胞内亚定位及定量分析的技术探讨从差异表达谱筛选的某些与卵母细胞体外成熟相关生物标记物。材料与方法:⑴小鼠IVM模型建立:3周龄雌性ICR小鼠,予腹腔注射孕马血清(PMSG)5U/只常规促排卵,获取未成熟卵丘卵母细胞复合体(GV-COCs),参照国内外文献建立小鼠IVM平台。⑵CCs差异表达谱:分别从GV-COCs和MII-COCs中剥取CCs,对应于GV-CCs组和MII-CCs组,每组包含3个混合CCs样品(每个混合样品含100枚COC)。分别提取总RNA,运用基因芯片技术获得差异表达谱。⑶生物信息学分析:确定差异表达基因、差异细胞功能和事件,并选择某些候选研究基因。⑷基因芯片结果验证:根据芯片结果中的生物信息学分析结果,结合现有文献报道,挑选出感兴趣的目的基因,运用与芯片上样时同样的样品行q-PCR水平验证。⑸差异基因的生物学意义:在芯片结果验证的基础上,确定一些功能基因。扩大样本量,每组8个样品(每个样品含30枚COCs),重新收集样品,行q-PCR验证。⑹目的基因的蛋白水平表达差异:分别从GV-COCs和MII-COCs中剥取CCs,通过Western Blot对以上确定的功能基因行蛋白水平的定量研究,免疫荧光方法进行细胞内定位的研究。⑺统计方法:采用SPSS20.0统计软件对数据进行分析。计数资料(MII率)统计采用卡方检验;计量资料(目的基因的蛋白表达和m RNA表达水平)以均数±标准差(Means±SD)表示,采用独立样本t检验进行分析。P0.05为差异有统计学意义。结果:⑴在本中心成功复制小鼠IVM模型,获得GV-COCs和IVM后的MII-COCs,其平均成熟率(MII%)稳定在92.6%。⑵通过基因芯片,获得了IVM前后CCs上基因表达谱变化。按照FC≥3.0(Fold Change),同时P≤0.05筛选标准进行差异表达基因分析。①MII对GV上调基因有2615个,主要涉及基质金属蛋白酶调节及表皮生长因子受体结合等功能;②MII对GV下调基因有2810个,主要涉及细胞核内相关生物学事件。⑶q PCR验证芯片结果,发现IVM以后CCs上ECM和EFG相关基因(PTGS2,EREG,TNFAIP6,EFEMP1)以及线粒体代谢相关基因(FDX1,AIFM2)表达上调了;缝隙链接及细胞周期相关基因(GJA1,GJA4,CCND2,CCNA2,CCNB2)表达下调了。与芯片结果一致。⑷从以上目的基因中进一步筛选出功能基因(EFEMP1,FDX1,GJA1,CCND2),重新收集样品进行生物学意义的验证,与芯片结果一致。⑸筛选出4个因子(EFEMP1,FDX1,GJA1,CCND2)进行蛋白定量研究,发现与m RNA水平的变化一致。细胞内定位研究发现:①EFEMP1主要定位CCs的胞质中,在GV-COC中仅表达在表层CCs上,内层CCs不表达,且在GV期卵子中不表达;经过IVM后,EFEMP1表达在全层CCs上,且MII其卵母细胞中高表达;②FDX1也主要定位于CCs胞质中,在GV-COC中内外层CCs均有FDX1的表达,且GV期卵母细胞中也有表达;IVM后表达阳性的CCs数目明显增多;③GJA1只表达在CCs胞质中,不表达与胞核中,在GV-COC中,GJA1在各层CCs中均有表达;IVM后阳性细胞数目明显减少。且在GV期和MII期卵母细胞内,GJA1均不表达;④CCND2主要表达在CCs的胞核中,胞质中少量表达,在GV-COC中,其主要表达在内层CCs中;IVM以后这种表达极性消失,且荧光强度明显减弱。结论:⑴研究生期间掌握了小鼠卵母细胞显微镜下操作技术,在本中心成功复制IVM模型并应用于课题研究中。⑵IVM过程中,随着卵母细胞成熟,CCs上的基因表达谱发生一系列变化。IVM以后CCs上金属蛋白酶调节及表皮生长因子受体结合相关的基因表达上调了,细胞核相关的基因表达下调了。基因芯片结果利用q PCR技术进行了验证。⑶通过扩大样本量验证,表明功能基因(EFEMP1,FDX1,GJA1,CCND2)在IVM过程中差异表达,具有重要的生物学意义。⑷IVM过程中,随之卵母细胞成熟的进程CCs一些上调的因子(EFEMP1和FDX1)和下调因子(GJA1和CCND2)可望作为卵母细胞成熟及质量相关的生物标记物,也可能发展成为改进IVM培养液的靶因子。
【关键词】：卵丘细胞 卵母细胞体外成熟 基因表达谱 生物标记 卵母细胞发育潜能
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R714.8
【目录】：

• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-15
• 前言15-20
• 材料与方法20-32
• 结果32-43
• 讨论43-55
• 结论55-56
• 参考文献56-65
• 文献综述65-86
• 参考文献78-86
• 英汉缩略语名词对照86-88
• 攻读硕士学位期间发表文章情况88-89
• 致谢89

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