桑树MAPK基因家族信息分析与功能研究

发布时间：2017-05-12 00:03

  本文关键词：桑树MAPK基因家族信息分析与功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：生物和非生物逆境胁迫因子(如病原侵害、干旱、高盐和高低温等)严重影响农作物的生长发育以及产量和品质。植物对胁迫应答响应是一个涉及基因、信号传导途径以及基因表达产物协同参与的过程,这个过程又分为到4个阶段：植物对胁迫信号的感知、胁迫信号的传递、膜受体对胁迫信号的识别与传导和相关抗逆基因的表达。在这其中,蛋白激酶是植物体内一类重要的调节酶,通过膜受体感知外界环境胁迫信号,引起细胞内一些离子和分子浓度改变,激活不同蛋白磷酸化途径。而促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK),它是普遍存在于真核生物中的一类保守的丝氨酸／苏氨酸类蛋白激酶,在植物生长发育和多种生物、非生物胁迫信号转导过程中起着关键作用。 桑树是一种对环境有极强的适应性的多年生生态经济树种,具有耐盐碱、耐旱、耐涝和耐寒等多种特性。但其逆境生理、生化和分子生物学研究极少。关于桑树抗性的研究主要集中在抗性种子资源的筛选及抗性生理指标的测定,桑树抗性基因的研究并不多见。虽然MAPK在一些植物中已经被鉴定并验证功能,但是在公共数据库(如NCBI, EMBL等)中没有桑树MAPK的相关报道。随着川桑基因组的完成,使在全基因组水平分析桑树MAPK抗性基因家族成为可能,这对于探明MAPK胁迫信号转导调控机理以及植物对生物和非生物胁迫适应机制具有重要意义,为桑树分子改良提供研究基础。 本研究基于川桑基因组数据库,利用生物信息学方法对预测的桑树MAPK基因家族根据其氨基酸序列和保守基序进行分类和系统发生分析,从中鉴定出47个桑树MAPK (MnMAPK)家族基因：32个MnMAPKKK5个MnMAPKK和10个MnMAPK基因。并对其中的10个MnMAPK基因的基因结构、上游启动子保守元件、氨基酸保守序列及与其他植物中MAPK蛋白序列进行系统进化分析；并对其克隆序列与川桑基因组数据库进行比对分析；以生长2个月(高度约25cm)的湖桑幼苗为材料,对其进行不同的胁迫(高温,低温,高盐和干旱)和信号分子(ABA, SA, H2O2和MeJA)处理,通过qRT-PCR分析桑树MAPK基因在不同胁迫诱导条件下的表达情况；基于胁迫诱导表达谱筛选出候选的MnMAPK6基因进行哑细胞定位,构建植物超量表达载体农杆菌介导转化模式植物拟南芥,获得转基因拟南芥植株,对转基因拟南芥进行高温,干旱,高盐,H202等处理,观察其对转基因植株的尘长发育和非生物胁迫耐受情况。本研究的主要研究结果如下： 1、川桑MAPK基因家族生物信息学分析和克隆 利用生物信息学方法在川桑基因组中鉴定得到47个桑树MAPKs家族基因：32个MnMAPKKK.5个MnMAPKK和10个MnMAPK基因。并对其中的10个MnMAPK基因的基因结构、上游启动子保守元件、氨基酸保守序列及与其他植物由MAPK蛋白序列进行系统进化分析,克隆了10个MnMAPK基因,序列验证发现川桑基因组数据库中MnMAPK2比川桑cDNA中克隆得到的MnMAPK2全长cDNA缺失15个核苷酸碱基,MnMAPK8存在两种剪接形式。MnMAPK基因CDS大小介于1107bp到1902bp之间,它们编码的蛋白质大小范围为368至633个氨基酸(aa),预测的蛋白质分子量在42.4kD和70.9kD的之间,等电点大小介于5.0到9.28之间。通过桑树MAPK氨基酸序列多重序列比与系统进化树分析发现,桑树MAPK分布在A-E组。 2、桑树MAPK基因非生物胁迫诱导表达分析 对川桑MAPK家族的10个基因设计qRT-PCR引物,以生长两个月的湖桑32号幼苗为材料,进行高温、低温、干旱、高盐非生物胁迫处理和ABA.SA.H2O2和MeJA四种信号分子处理,提取对照组和处理组材料的RNA反转录为cDNA,检测桑树MAPK基因在胁迫处理条件下的表达情况。结果表明,桑树MnMAPKs基因可以受到多种非生物胁迫的诱导,不同的桑树MAPK基因对不同的胁迫处理有不同的胁迫应答模式。 3、川桑MnMAPK6基因亚细胞定位与功能研究 MnMAPK6在桑树根、茎和叶三个组织在不同的非生物胁迫和不同的时间段处理后的表达模式不同,可以响应多种胁迫,暗示MnMAPK6参与了桑树非生物胁迫响应信号传导途径。 构建35S-MnMAPK6::EGFP瞬时表达载体,同时构建35S-EGFP表达载体作为对照,用农杆菌侵染法转化洋葱表皮细胞,结果显示MnMAPK6融合蛋白被定位在细胞核中。 构建MnMAPK6植物超量表达载体,浸花法转化拟南芥并获得转基因植株。不同的过表达植株GUS的表达量不同,并且表现出一定的组织差异性,其中OE6株系中GUS的表达量最高,OEl株系中GUS的表达量最低,MnMAPK6在获得的过表达转基因株系中的表达量也不相同,转基因株系OE6的MnMAPK6表达量最高,OE5和OE3次之,OE1的表达量最低。选取OE6,OE5和OEl这三个转基因株系来研究转基因拟南芥对胁迫刺激的耐受情况。结果显示,与野生型拟南芥相比,过表达转基因植株表现出对高盐和H202的耐受性提高,而对高温和干旱敏感。
【关键词】：桑树 MAPK 非生物胁迫 表达分析 亚细胞定位 转基因拟南芥
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：S888
【目录】：

• 摘要8-11
• ABSTRACT11-14
• 第一章 文献综述14-20
• 1.1 植物非生物胁迫和信号转导14
• 1.2 蛋白激酶与信号传导14-15
• 1.3 植物MAPK级联途径15-17
• 1.4 植物MAPK级联途径的功能17-20
• 1.4.1 MAPK与植物激素信号传递18
• 1.4.2 MAPK与干旱、高盐、高温和低温胁迫信号传递18-19
• 1.4.3 MAPK与植物病原信号传递19
• 1.4.4 桑树抗性基因相关研究19-20
• 第二章 引言20-24
• 2.1 研究背景及意义20
• 2.2 主要研究内容20-22
• 2.3 技术路线22-24
• 第三章 川桑MAPK基因家族生物信息学分析和克隆24-40
• 3.1 材料和试剂24-26
• 3.1.1 实验材料24
• 3.1.2 主要试剂24
• 3.1.3 主要试剂和缓冲液配方24-25
• 3.1.4 主要仪器25-26
• 3.2 方法26-31
• 3.2.1 川桑MAPK家族蛋白序列的获得26
• 3.2.2 RNA的提取与检测26-27
• 3.2.3 第一链cDNA的合成27-28
• 3.2.4 川桑MAPK基因家族的克隆与序列鉴定28-31
• 3.2.5 川桑MAPK基因家族的保守结构域和系统发育分析31
• 3.3 结果与分析31-38
• 3.3.1 川桑MAPK家族基因的分离与克隆鉴定31-36
• 3.3.2 MnMAPK系统发育树和结构域分析36-38
• 3.4 小结与讨论38-40
• 第四章 桑树MAPK基因非生物胁迫诱导表达分析40-48
• 4.1 材料和试剂仪器40-41
• 4.1.1 实验材料40
• 4.1.2 主要试剂40
• 4.1.3 主要仪器40-41
• 4.2 实验方法41-42
• 4.2.1 桑树幼苗的培养和胁迫处理41
• 4.2.2 RNA的提取与检测41
• 4.2.3 cDNA第一链的合成41
• 4.2.4 桑树MAPK基因定量引物设计41-42
• 4.2.5 桑树MAPK基因荧光定量PCR(qRT-PCR)42
• 4.3 结果与分析42-46
• 4.3.1 桑树MAPK基因胁迫诱导表达分析42-46
• 4.4 小结与讨论46-48
• 第五章 川桑MnMAPK6基因亚细胞定位与遗传转化48-76
• 5.1 实验材料和试剂48-52
• 5.1.1 实验材料48
• 5.1.2 主要试剂48-49
• 5.1.3 主要试剂和缓冲液配方49-52
• 5.1.4 主要仪器52
• 5.2 方法52-62
• 5.2.1 桑树幼苗的培养和胁迫诱导处理52-53
• 5.2.2 农杆菌感受态细胞的制备和转化53
• 5.2.3 MnMAPK6亚细胞定位载体构建洋葱表皮亚细胞定位53-56
• 5.2.4 洋葱表皮亚细胞定位瞬时表达转化56-57
• 5.2.5 植物超量表达载体的构建57-58
• 5.2.6 农杆菌介导浸花法转化拟南芥58-59
• 5.2.7 转基因拟南芥鉴定59-61
• 5.2.8 转基因拟南芥非生物胁迫处理61-62
• 5.3 结果与分析62-74
• 5.3.1 MnMAPK6在桑树中的胁迫表达分析62-65
• 5.3.2 MnMAPK6亚细胞定位65
• 5.3.3 MnMAPK6植物转基因载体的构建65-66
• 5.3.4 MnMAPK6转基因拟南芥的获得与鉴定66-68
• 5.3.5 MnMAPK6转基因植株对非生物胁迫的响应情况68-74
• 5.4 小结与讨论74-76
• 第六章 综合与讨论76-78
• 参考文献78-84
• 附录84-86
• 在读期间发表论文及参研课题86-88
• 致谢88

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 何宁佳;赵爱春;秦俭;曾其伟;向仲怀;;桑树基因组计划与桑树产业[J];蚕业科学;2012年01期

2 裴丽丽;郭玉华;徐兆师;李连城;陈明;马有志;;植物逆境胁迫相关蛋白激酶的研究进展[J];西北植物学报;2012年05期

3 孙银苹;沈智超;雷朋;邸炳荣;刘利;潘刚;;桑树低温诱导基因Wap在不同地理来源桑品种幼叶中的表达差异[J];蚕业科学;2012年05期

4 宋鹏华;曾其伟;商敬哲;马峇;向仲怀;何宁佳;;植物对水淹胁迫响应的研究进展[J];蚕业科学;2013年01期

5 胡风庆;MAPK对高等植物细胞分裂和生长的调节[J];中国生物工程杂志;2002年05期

6 陈尚武,黄迪,陈瑞君,朱振宇,马涧泉;EB病毒胸苷激酶基因的定向克隆[J];生物技术;1997年01期

7 吴涛;宗晓娟;谷令坤;李德全;;植物中的MAPK及其在信号传导中的作用[J];生物技术通报;2006年05期

8 周庆红,李成琼,匡全;植物蛋白激酶研究进展[J];生物学杂志;2003年03期

9 朱斌;梁颖;;植物MAPK C族基因的研究进展[J];生物技术通报;2012年11期

10 何秀萍,张博润;酵母菌细胞完整性信号途径及其上游调控因子的研究[J];微生物学报;2002年03期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 刘玉鲲;玉米MAPK基因家族的鉴定及ZmMPK4基因对的功能分析[D];山东农业大学;2011年

  本文关键词：桑树MAPK基因家族信息分析与功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：358328