鹿茸发育相关基因筛选和生物信息学分析

发布时间：2017-05-13 16:17

  本文关键词：鹿茸发育相关基因筛选和生物信息学分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】： 鹿茸是一种骨质性器官,每年都能脱落后再生,是哺乳动物中唯一能完全再生的器官,其他的哺乳动物无法再生出失去的器官。因此,鹿茸就提供了一个绝无仅有的模型来研究哺乳动物内在的再生机制。然而,鹿茸再生的分子机制至今没有弄清楚。鹿茸发育是一个非常独特的复杂的过程,涉及到软骨内成骨和膜内成骨等骨生长方式。许多研究表明鹿茸再生是基于干细胞(骨膜细胞),不涉及到细胞的去分化,不同于蝾螈肢体再生过程。鹿茸再生首先形成胚芽或茸芽状的复杂结构,在这个微环境中,存在细胞分裂、分化,鹿茸发育的干细胞,多能祖细胞受到复杂的信号调控。在梅花鹿的鹿茸发育中,细胞分化、增殖和凋亡都是受特定基因表达调控。鹿茸顶端的间充质组织在鹿茸顶端的形态发生,乃至整个鹿茸的发育过程中起着重要的作用。 本实验运用cDNA-AFLP技术筛选梅花鹿鹿茸发育过程中两个重要时期的间充质组织的差异表达基因片段,获得鹿茸发育相关的基因。这种技术是用两种限制性内切酶酶切,在严格的条件下,64对引物组合进行扩增,扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,再进行银染,筛选出鹿茸发育过程中差异表达的转录本,然后用RT-PCR进行鉴定,该实验可重复性强。得到许多两个发育时期的鹿茸差异表达基因,选取9个差异表达基因进行克隆测序,然后进行EST生物信息学分析。首先对EST序列进行预处理、聚类和拼接,把来源于同源于同一基因EST拼接成contig,其次利用nr数据库,EST数据库和GO数据库,获得更多的信息,并对EST进行功能注释。 结果表明有两个片段来源于同一个基因,利用生物软件拼接成contig ,即AF78,把未能拼接ESTs和此contig(AF78)进行比对分析和功能注释,获得相关基因信息。上调基因有2个,即AF1和AF2。AF1功能未知,AF2的同源序列是人的TRPV4,TRPV4通道是瞬时感受器电位离子通道家族香草素受体亚家族成员,属非选择性阳离子通道,对钙离子具有适中通透性,在软骨的形成中起着重要的作用。下调基因有6个,即AF3-AF6,AF78 (contig)和AF9。其中AF6基因功能未知,AF3的同源序列是人的FAS,该基因是促凋亡基因,属于肿瘤坏死因子受体家族成员之一,与哺乳类动物细胞凋亡密切相关;AF4的同源序列是人的WNT3,是Wnt基因家族成员,在细胞增殖、分化过程中起着重要的作用, Wnt信号通路在发育过程中具有重要的作用;AF5的同源序列是人的TGFβ1,是转化生长因子β超家族的成员,该基因编码的是一种分泌性蛋白,扮演着许多细胞功能,如对细胞生长,细胞增殖和分化,还有凋亡的调控;AF78的同源序列是猕猴的CDK2,周期依赖性激酶2,该基因编码的是蛋白激酶家族的一员,启动真核细胞周期的关键时期; AF9的同源序列是人的APAF1,该基因称为凋亡酶激活因子-1,在凋亡途径中具有重要作用。这些功能已知的基因都与信号转导,如Wnt/β-action , TGF/TGFR等信号通路;细胞分裂、增殖、分化和凋亡有关,在鹿茸的发育过程中起着重要的作用,有些基因是鹿茸研究中首次提到的,有些是新基因,都通过RT-PCR进行了验证。本实验为鹿茸再生和器官再生的进一步研究奠定了基础。
【关键词】：cDNA-AFLP 差异基因表达 鹿茸发育 鹿茸再生 间充质组织 表达序列标签 生物信息学分析
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：S865.42
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 第一章 绪论12-29
• 1.1 鹿茸发育与再生机理的研究进展12-17
• 1.1.1 鹿茸发育概述12-15
• 1.1.2 鹿茸再生及创伤修复15
• 1.1.3 鹿茸生长过程中的组织学15
• 1.1.4 鹿茸发育再生调控15-17
• 1.2 差异表达基因的筛选方法17-24
• 1.2.1 cDNA-RAPD 分析法17
• 1.2.2 m RNA 差异显示17-18
• 1.2.3 代表性差别分析18-19
• 1.2.4 cDNA-AFLP19-21
• 1.2.5 抑制消减杂交法21
• 1.2.6 基因表达系列分析21-23
• 1.2.7 cDNA 微阵列23-24
• 1.3 生物信息学分析核酸概述24-28
• 1.3.1 载体和重复序列分析25-26
• 1.3.2 序列聚类拼接26-27
• 1.3.3 基因注释及功能分类27-28
• 1.4 本实验的目的和意义28-29
• 第二章 鹿茸生长发育相关基因的分离克隆29-45
• 2.1 前言29
• 2.2 材料与方法29-37
• 2.2.1 主要试剂29
• 2.2.2 主要仪器29-30
• 2.2.3 样品采集30
• 2.2.4 m RNA 的提取30-31
• 2.2.5 cDNA-AFLP 分析31-35
• 2.2.6 差异片段的克隆35-37
• 2.3 结果与分析37-42
• 2.3.1 m RNA 的质量检测37
• 2.3.2 双链cDNA 的质量检测37-38
• 2.3.3 酶切结果38
• 2.3.4 酶切产物的预扩增38-39
• 2.3.5 选择性扩增39
• 2.3.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染39
• 2.3.7 部分差异片段的克隆和测序39-41
• 2.3.8 RT-PCR 验证41-42
• 2.4 讨论42-45
• 第三章 差异表达基因片段生物信息学处理及功能分析45-62
• 3.1 前言45
• 3.2 材料与方法45-51
• 3.2.1 去除载体序列45-46
• 3.2.2 去除重复序列和污染序列46
• 3.2.3 EST 的聚类和拼接46-48
• 3.2.4 EST 数据注释48-50
• 3.2.5 蛋白质结构域和功能位点的预测50-51
• 3.2.6 EST 功能分类(gene ontology)51
• 3.3 结果与分析51-60
• 3.3.1 聚类组装51-52
• 3.3.2 EST 数据注释52-55
• 3.3.3 蛋白质结构域和功能位点的预测55-60
• 3.3.4 EST 的功能分类60
• 3.4 讨论60-62
• 第四章 全文总结62-65
• 4.1 全文讨论62-64
• 4.1.1 cDNA-AFLP 技术与鹿茸发育相关特异cDNA 片段的筛选62
• 4.1.2 鹿茸发育相关特异cDNA 片段生物信息学分析62-64
• 4.2 全文结论64-65
• 参考文献65-69
• 致谢69-70
• 作者简历70-71
• 附录Ⅰ CDNA-AFLP 银染结果71-73
• 附录Ⅱ EST 序列73-74
• 附录Ⅲ 生物信息学分析相关图片74-79
• 附录Ⅳ 试剂配制79

【引证文献】

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 孙浩然;鹿茸细胞端粒酶及其生长相关蛋白的检测与分析[D];吉林大学;2011年

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本文编号：363026