黄牛肌肉生长发育相关基因甲基化鉴定及IGF2和ZBED6基因的转录调控研究

发布时间：2017-05-16 06:18

  本文关键词：黄牛肌肉生长发育相关基因甲基化鉴定及IGF2和ZBED6基因的转录调控研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：我国地方黄牛具有独特的基因资源，如何从遗传学和表观遗传学的角度来阐释肉用性状形成的原因及其分子调控机制，将成为我国黄牛遗传改良工作的研究重点。本研究以中国黄牛作为研究对象，利用甲基化DNA免疫共沉淀测序（MeDIP-Seq）、亚硫酸氢盐测序PCR（BSP）、结合重亚硫酸盐处理和酶切分析（COBRA）、实时荧光定量PCR（QPCR）、蛋白质免疫印迹（Western blot）、DNA池测序、Forced-PCR-RFLP、基因克隆、细胞培养、腺病毒的包装以及真核表达等现代生物技术进行了两个方面的试验研究：第一，研究了秦川牛胎牛和成年时期的背部肌肉组织的全基因组DNA甲基化修饰图谱，筛选出甲基化和表达差异显著的基因及其作用的信号通路；第二，研究了与肌肉生长发育相关基因（ZBED6及其靶基因IGF2）的遗传变异及其对黄牛生长性状的转录调控的影响，分析了其组织表达谱、启动子活性、甲基化水平，以及在细胞水平上的表观转录调控功能。 主要研究内容和结果如下： 1、黄牛肌肉生长发育相关甲基化基因的筛选及其功能鉴定 （1）MeDIP-Seq分析牛肌肉组织的全基因组甲基化图谱：首次绘制出牛2个关键生长发育时期（胎牛和成年牛）肌肉组织全基因组水平的DNA甲基化图谱，发现两组样品测序Reads在每条染色体的尾端富集程度高于其他区域，高甲基化区域的长度主要集中在900~1000bp，大多含有10~15个CpG，高甲基化区域在5’非翻译区（5’UTR）和编码区（CDS）基因元件上覆盖度（即覆盖碱基数与该区域碱基总数的比值）最高。 （2）样品间各表达水平基因在基因及附近区域的甲基化修饰分布趋势：成年牛在基因内及其上下游2kb区域的整体DNA甲基化水平高于胎牛，不同表达水平基因的DNA甲基化水平不同，基因的表达水平和其对应的DNA甲基化修饰程度呈负相关，即基因的mRNA表达水平越高，其DNA甲基化水平越低，反之亦然。特别是基因的转录起始位点最为明显。 （3）样品间全基因组表达差异基因和甲基化差异基因统计：表达水平上调基因有1,885个，下调基因有4,889个；启动子（Promoter）区域甲基化水平上调基因有235个，下调基因有143个，该区域甲基化和表达水平负相关的基因共有77个。基因体（Genebody）区域甲基化水平上调基因有3,504个，下调基因有2,313个，该区域甲基化和表达水平负相关的基因有1054个。 （4）样品间全基因组甲基化差异基因的GO功能显著性富集分析：在Promoter区143个下调基因的分子功能分类中，有1项显著富集条目，其功能都与甲基转移酶活性相关。在基因CDS区1076个上调基因的分子功能分类中，有9项显著富集条目，其中大部分功能都与核苷酸结合和磷酸酶调节活性相关；792个下调基因的分子功能分类中，有8项显著富集条目，其中大部分功能都与核苷酸结合和运输活性相关；在生物过程分类中，大部分功能都与甲基转移酶活性相关，有1项显著富集条目是移动。 （5）样品间全基因组甲基化差异基因的通路（Pathway）显著性富集分析：在Promoter区，下调基因参与的通路有93个，上调基因参与的通路有143个，均无显著富集的通路；在CDS区，下调基因参与的通路有195个，显著富集的通路是粘着斑，有34个下调基因显著富集到该通路；上调基因参与的通路有209个；无显著富集的通路。 （6）样品间全基因组表达和甲基化负相关基因的GO功能显著性富集分析：两组样品在基因Promoter和Gene body区域负相关基因都没有显著富集的GO项。 （7）样品间全基因组表达和甲基化负相关基因的通路（Pathway）分析：在Promoter区，77个负相关基因参与的通路有81个，显著性富集通路有2个，分别是柠檬酸循环和轴突导向。在Gene body区，1054个负相关基因参与的通路有204个，显著性富集通路有3个，分别是紧密连接，调节肌动蛋白细胞骨架和维生素的消化和吸收。 （8）样品间全基因组启动子区表达和甲基化负相关基因的定量验证分析：利用QPCR技术在秦川牛3个不同发育时期9种不同组织中，，对启动子区负相关的48个基因进行了表达谱分析，其中有45个基因的定量验证结果和甲基化测序结果一致。 2、黄牛IGF2和ZBED6基因mRNA表达及其与DNA甲基化水平相关性研究 利用QPCR、BSP和COBRA分析发现：牛IGF2和ZBED6基因在2个发育时期6中组织中mRNA表达量和甲基化水平呈现负相关，以胎牛时期的表达量和甲基化水平为对照组，ZBED6在肝脏、肺脏和脾脏的mRNA表达量均有所上升，而DNA甲基化水平均有所下降；IGF2在肌肉、心脏、肺脏和脾脏的表达量均有所下降，而甲基化水平均有所上升。 3、黄牛IGF2和ZBED6基因SNPs检测及其与生长性状的效应分析 本研究利用DNA池测序分析结果发现：在IGF2基因内含子8区域发现4处非编码突变，分别命名为IVS8-17GA，-220CT，-221AG和-1393AG。在ZBED6基因上游区域发现1处非编码突变和编码区发现2处错义突变，分别命名为-826GA，680CG和1043AG；关联分析结果显示：在南阳牛和郏县红牛群体中，不同基因型对5个关键生长发育时期的体重显著相关；在秦川牛群体中，不同基因型与成年基础母牛的10项体尺和体重指标性状显著相关；两个基因的突变型个体大于野生型个体（P0.01或者P0.05）。 4、转录因子ZBED6对IGF2基因转录活性及调控特征的研究 （1）生物信息学分析结果显示，在ZBED6基因启动子突变型M-826A的序列上，发现一个新结合的转录因子PLZF，PLZF可能作为抑制因子参与了抑制ZBED6的转录活性，而参与上调动物机体的造血功能，脂肪和肌肉细胞增殖及分化过程。 （2）双荧光素酶检测系统的检测结果显示：在启动子-866bp到-556bp位置之间的片段活性最高，野生型M-826G-pGL3的启动子活性显著高于突变型。IGF2基因IVS3-3106GA突变后的3个不同长度片段的启动子序列的活性显著上调，其中长度为439bp启动子截短体序列的活性最强；过表达ZBED6基因对IGF2基因的启动子活性有极显著的下调作用。 （3）QPCR分析结果显示：ZBED6基因编码区发生突变的单倍型个体在秦川牛肌肉组织中的mRNA表达量显著下降，IGF2基因mRNA表达量显著上升。在体外培养的C2C12细胞中，过表达ZBED6可引起IGF2基因mRNA表达量显著上升。 以上结果可知，转录因子ZBED6可与IGF2基因内含子3区域突变位点（3106A）附近的序列结合来发挥其对IGF2基因转录活性的抑制调控功能。 5、抑制因子ZBED6基因腺病毒干扰载体的构建及其功能研究 筛选出具有明显干扰效果的shRNA（pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-906）并进行了病毒重组和包装；重组的腺病毒干扰载体感染牛原代肌肉细胞，QPCR、半定量PCR和Western blot的检测结果显示，ZBED6表达量下调，IGF2基因表达量明显上调，揭示了干扰转录因子ZBED6，可失去其对IGF2基因的抑制作用。 6、抑制因子ZBED6基因腺病毒过表达载体的构建及其功能研究 构建了牛Ad-ZBED6重组腺病毒超表达载体；包装和扩繁得到高滴度的超表达腺病毒；重组的过表达腺病毒Ad-ZBED6感染牛原代肌肉细胞，QPCR、半定量PCR和Westernblot的检测结果显示，ZBED6表达量上调，IGF2基因表达量明显下调，揭示了过表达转录因子ZBED6可增加其对IGF2基因的抑制作用。 以上的研究结果显示，在黄牛不同发育时期的肌肉组织中存在大量DNA甲基化修饰和mRNA表达差异的基因，这些差异基因主要与肌肉细胞的生长分化和代谢相关；在细胞、个体和群体水平上鉴定了与肌肉生长发育相关的功能基因ZBED6及其靶基因IGF2，研究这两个关键基因在转录前、转录后和翻译过程中的相互调控作用，从而系统地从遗传和表观遗传调控等方面揭示与肌肉生长发育相关基因的功能与分子调控机制，这不仅对全方位阐明黄牛肉用性状遗传和调控的分子机理具有重要科学意义，而且为黄牛肉用选育和高效生产提供科学理论依据。
【关键词】：黄牛 肌肉 MeDIP-Seq 甲基化 ZBED6基因
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：S823.81
【目录】：

• 摘要6-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-19
• 文献综述19-36
• 第一章 表观遗传学和 DNA 甲基化研究概述19-30
• 1.1 表观遗传学研究概述19-20
• 1.1.1 表观遗传学与表观遗传19
• 1.1.2 表观遗传学的研究内容及其特点19-20
• 1.2 表观遗传学所涉及的主要机制20-24
• 1.2.1 DNA 甲基化20-21
• 1.2.2 非编码 RNA 调控!21-23
• 1.2.3 组蛋白修饰23-24
• 1.2.4 染色质重塑24
• 1.3 DNA 甲基化抑制基因表达的机制24-25
• 1.4 DNA 甲基化的生物学功能25-26
• 1.4.1 维持基因组稳定25
• 1.4.2 调控基因表达25
• 1.4.3 参与其它表观遗传学修饰25
• 1.4.4 调节动物生长发育25
• 1.4.5 影响杂种优势25-26
• 1.4.6 影响老化26
• 1.5 DNA 甲基化的检测方法26-29
• 1.5.1 DNA 甲基化与 CpG 岛26
• 1.5.2 全基因组甲基化模式（pattern）与甲基化谱（profiling）分析26-27
• 1.5.3 候选基因特异位点甲基化水平分析27-29
• 1.6 小结29-30
• 第二章 印迹基因 IGF2 和转录因子 ZBED6 研究概述30-36
• 2.1 IGF2 基因的研究概述30-31
• 2.1.1 IGFs 系统的组成及其生物学功能30
• 2.1.2 IGF2 基因的印迹调控现象30-31
• 2.1.3 IGF2 基因与肌肉生长发育的关系31
• 2.2 ZBED6 基因的研究概述31-35
• 2.2.1 锌指蛋白的结构与功能31-32
• 2.2.2 ZBED 基因家族成员概述32-33
• 2.2.3 ZBED6 基因的发现33-35
• 2.2.4 ZBED6 基因的功能35
• 2.3 小结35-36
• 实验研究36-174
• 第三章 黄牛肌肉生长发育相关甲基化基因的筛选及其功能鉴定36-89
• 3.1 材料与方法37-41
• 3.1.1 试验动物37
• 3.1.2 样品采集37
• 3.1.3 RNA 的提取、检测和 cDNA 合成37
• 3.1.4 DNA 的提取与检测37-38
• 3.1.5 实时定量 PCR（QPCR）分析38-39
• 3.1.6 MeDIP-Seq 文库制备流程39-40
• 3.1.7 MeDIP-Seq 信息分析流程40-41
• 3.2 MeDIP-Seq 高通量信息分析41-44
• 3.2.1 MeDIP-Seq 数据处理41-42
• 3.2.2 MeDIP-Seq 序列与参考序列的比对42
• 3.2.3 MeDIP-Seq 数据的全基因组分布趋势42
• 3.2.4 MeDIP-Seq 数据高甲基化富集区域（Peak）分析42-43
• 3.2.5 基于高甲基化富集区域（Peak）的两个样品间差异性分析43-44
• 3.3 MeDIP-Seq 和 RNA-Seq 的联合分析44-46
• 3.3.1 Reads 在基因组上的比对情况及分布44
• 3.3.2 全基因组水平上基因表达与甲基化的分布规律44-45
• 3.3.3 各表达水平基因在基因及附近区域的甲基化修饰45
• 3.3.4 各类甲基化修饰区域基因的平均表达水平45
• 3.3.5 样品间基因甲基化修饰对表达的调控45-46
• 3.3.6 两样品间甲基化与表达呈负相关的基因的功能分析46
• 3.4 MeDIP-Seq 高通量测序结果与分析46-65
• 3.4.1 牛基因组 DNA 样品的检测46-47
• 3.4.2 MeDIP-Seq 数据处理47
• 3.4.3 MeDIP-Seq 序列与参考序列的比对47
• 3.4.4 MeDIP-Seq 测序数据全基因组分布趋势47-53
• 3.4.5 MeDIP-Seq 数据高甲基化富集区域（Peak）分析53-58
• 3.4.6 基于高甲基化区域（Peak）的多样品间甲基化差异性分析58-65
• 3.5 MeDIP-Seq 和 RNA-Seq 测序结果及其联合分析65-86
• 3.5.1 Reads 在基因组上的比对情况及分布65-67
• 3.5.2 全基因组水平上基因表达与甲基化的分布规律67-69
• 3.5.3 各表达水平基因在基因及附近区域的甲基化修饰69-71
• 3.5.4 各类甲基化修饰区域基因的平均表达水平71-73
• 3.5.5 样品间基因甲基化修饰对表达的调控73-75
• 3.5.6 两样品间甲基化与表达呈负相关的基因的功能分析75-78
• 3.5.7 两样品间启动子区甲基化与表达呈负相关的基因的 QPCR 验证分析78-86
• 3.6 讨论86-87
• 3.7 小结87-89
• 第四章 黄牛 IGF2 和 ZBED6 基因 mRNA 表达及其与 DNA 甲基化水平相关性研究89-106
• 4.1 材料与方法89-96
• 4.1.1 试验动物89
• 4.1.2 样品采集89-90
• 4.1.3 RNA 的提取、检测和 cDNA 合成90
• 4.1.4 DNA 的提取与检测90
• 4.1.5 实时定量 PCR（QPCR）分析90
• 4.1.6 亚硫酸氢盐测序 PCR（BSP）90-92
• 4.1.7 结合重亚硫酸盐处理和酶切（COBRA）分析92-96
• 4.1.8 统计分析96
• 4.2 结果96-104
• 4.2.1 实时定量 PCR（QPCR）分析96-98
• 4.2.2 亚硫酸氢盐测序 PCR（BSP）分析98-102
• 4.2.3 结合重亚硫酸盐处理和酶切（COBRA）分析102-104
• 4.3 讨论104-105
• 4.4 小结105-106
• 第五章 黄牛 IGF2 和 ZBED6 基因 SNPs 检测及其与生长性状的效应分析106-122
• 5.1 材料与方法106-109
• 5.1.1 实验动物106-107
• 5.1.2 主要试剂107-108
• 5.1.3 候选基因 SNPs 的筛查108
• 5.1.4 资料的统计与分析108-109
• 5.2 结果与分析109-120
• 5.2.1 候选基因DNA池测序分析109
• 5.2.2 利用Forced PCR-RFLP检测SNPs109-112
• 5.2.3 候选基因SNPs的群体遗传参数分析112-113
• 5.2.4 候选基因SNPs的连锁不平衡和单倍型分析113-116
• 5.2.5 候选基因SNPs与生长性状的关联分析116-119
• 5.2.6 候选基因SNPs组合基因型与生长性状的关联分析119-120
• 5.3 讨论120-121
• 5.4 小结121-122
• 第六章 转录因子 ZBED6 对 IGF2 基因转录调控研究122-144
• 6.1 材料与方法122-133
• 6.1.1 试验材料122-123
• 6.1.2 试验仪器123
• 6.1.3 试剂配制123
• 6.1.4 生物信息学分析转录因子结合位点123
• 6.1.5 双色荧光报告载体的构建123-129
• 6.1.6 过表达载体的构建129-131
• 6.1.7 细胞培养和转染131-132
• 6.1.8 荧光素酶活性分析132
• 6.1.9 实时定量 PCR（QPCR）分析132-133
• 6.1.10 Western Blot 分析133
• 6.1.11 统计分析133
• 6.2 结果133-142
• 6.2.1 ZBED6 基因启动子区域转录因子分析133-134
• 6.2.2 ZBED6 基因启动子区域活性分析134-137
• 6.2.3 IGF2 基因定点突变重组体启动子活性分析137
• 6.2.4 过表达 ZBED6 对 IGF2 启动子活性的影响137-139
• 6.2.5 不同单倍型个体 ZBED6 和 IGF2 表达量比较139-140
• 6.2.6 ZBED6 对 IGF2 转录调控的影响140-142
• 6.3 讨论142-143
• 6.4 小结143-144
• 第七章 ZBED6 基因腺病毒干扰载体的构建及其功能研究144-161
• 7.1 材料与方法144-153
• 7.1.1 试验材料144-145
• 7.1.2 试验仪器145
• 7.1.3 pDsRed1-N1-ZBED6 表达载体的构建145-148
• 7.1.4 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA 载体的构建148-151
• 7.1.5 有效 shRNA 序列的筛选151
• 7.1.6 重组 ZBED6-shRNA 腺病毒载体构建与鉴定151-152
• 7.1.7 重组 shRNA 腺病毒包装、扩增及滴度测定152
• 7.1.8 重组 shRNA 腺病毒的滴度测定152
• 7.1.9 最佳感染强度的确定152-153
• 7.1.10 牛原代肌肉细胞的培养153
• 7.1.11 重组 shRNA 腺病毒干扰效果研究153
• 7.2 结果与分析153-160
• 7.2.1 pDsRed1-N1-ZBED6 载体的构建153
• 7.2.2 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA 载体的构建153-155
• 7.2.3 有效 shRNA 的筛选155-156
• 7.2.4 重组 shRNA 腺病毒载体的包装及扩增156-157
• 7.2.5 重组 shRNA 腺病毒滴度测定157-158
• 7.2.6 最佳感染强度的确定158
• 7.2.7 重组 shRNA 腺病毒载体的干扰效率158
• 7.2.8 重组 shRNA 腺病毒载体干扰效果研究158-160
• 7.3 讨论160
• 7.4 小结160-161
• 第八章 ZBED6 基因腺病毒过表达载体的构建及其功能研究161-172
• 8.1 材料与方法161-166
• 8.1.1 试验材料161-162
• 8.1.2 试验仪器162
• 8.1.3 腺病毒穿梭载体 pAdTrack/CMV-ZBED6 构建162-164
• 8.1.4 腺病毒穿梭载体 Pme I 线性化164
• 8.1.5 腺病毒穿梭载体与骨架载体 pAdEasy-1 的重组164-166
• 8.1.6 重组腺病毒 Ad-ZBED6 的包装与扩增166
• 8.1.7 重组腺病毒 Ad-ZBED6 滴度测定166
• 8.1.8 最佳感染强度的确定166
• 8.1.9 重组腺病毒 Ad-ZBED6 的功能研究166
• 8.2 结果与分析166-171
• 8.2.1 穿梭载体 pAdTrack/CMV-ZBED6 的构建166
• 8.2.2 重组质粒 Ad-ZBED6 的 Pac I 酶切鉴定166-167
• 8.2.3 腺病毒载体 Ad-ZBED6 的包装及扩增167-168
• 8.2.4 重组过表达腺病毒滴度测定168-169
• 8.2.5 最佳感染强度的确定169
• 8.2.6 重组腺病毒 Ad-ZBED6 的超表达效率169
• 8.2.7 重组腺病毒 Ad-ZBED6 的功能研究169-171
• 8.3 讨论171
• 8.4 小结171-172
• 第九章 结论与创新点172-174
• 9.1 结论172-173
• 9.2 创新点173-174
• 参考文献174-187
• 附录（第三章）187-228
• 附录（第四章）228-230
• 附录（第五章）230-256
• 附录（第六章）256-281
• 附录（第七章）281-287
• 缩略词287-289
• 致谢289-290
• 个人简介290-293

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

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  本文关键词：黄牛肌肉生长发育相关基因甲基化鉴定及IGF2和ZBED6基因的转录调控研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：369731