灰毡毛忍冬新品种ISSR分子标记及组织培养的研究

发布时间：2017-05-24 18:27

  本文关键词：灰毡毛忍冬新品种ISSR分子标记及组织培养的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：灰毡毛忍冬(Lonicera macranthoides Hand.-Mazz)又名拟大花忍冬、大银花等,是忍冬科忍冬属多年生半常绿小灌木植物,其花蕾绿原酸含量在全国各种药用忍冬植物中最高,是湖南、重庆、贵州等地药用忍冬植物生产的主栽品种。虽然我国药用忍冬植物产业取得了长足的发展,但是,仍存在着良种缺乏,品种混杂,干花产量和药用活性成份绿原酸含量低,繁殖技术落后,育苗周期长,繁殖系数小等系列问题,从而制约了我国药用忍冬植物产业健康可持续发展。本文以灰毡毛忍冬新品种‘金翠蕾’、‘银翠蕾’和‘白云’为研究对象,研究了灰毡毛忍冬新品种ISSR分子标记和组织培养,系统地分析了新品种组织培养增殖分化及生根过程中的内源激素、内源多胺的变化规律和调控作用,旨有效地从分子水平鉴别灰毡毛忍冬新品种,建立新品种高效组培快繁技术体系,促进我国药用忍冬植物产业又好又快发展。主要研究结果如下： (1)灰毡毛忍冬新品种ISSR分子标记的研究。以灰毡毛忍冬叶片基因组DNA为模板,研究了退火温度、Taq DNA聚合酶的用量及模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+浓度等6种因素对ISSR—PCR扩增的影响,建立了灰毡毛忍冬ISSR-PCR的优化反应体系和扩增程序。利用优化的反应体系,从100条ISSR引物中筛选出10条能够扩增出清晰、稳定条带的引物。以该10条引物对3个灰毡毛忍冬新品种和其它19个药用忍冬植物品种基因组DNA扩增,共扩增出108条带,其中多态性条带96条,多态性条带比率为88.9%,说明药用忍冬植物的遗传多样性丰富。并利用该体系构建3个灰毡毛忍冬新品种和其它19个药用忍冬植物品种DNA指纹图谱,可从分子水平将3个新品种与现在药用忍冬植物品种进行鉴别；利用UPGMA和主成分分析,将22个供试药用忍冬植物品种划分为忍冬种群和灰毡毛忍冬种群2个大类,每一大类又分为北方种群与南方种群。研究发现,不同药用忍冬植物品种之间的遗传差异与地理环境的差异存在相关性。 (2)灰毡毛忍冬新品种组织培养的研究。以灰毡毛忍冬新品种金翠蕾、银翠蕾和白云为研究对象,采用单因素、双因素试验和正交试验设计,开展了外植体选择、灭菌处理、基本培养基、植物激素及其配比、D-生物素浓度、活性炭浓度、培养温度、移栽基质、移栽容器、组培生根苗消毒处理、降低生产成本措施等系列试验,建立了组织培养的无菌体系,获得了适宜的初代培养基：金翠蕾和银翠蕾为MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1,白云则为MS+6-BA1.0mg·L-1+IBA0.1mg·L-’；筛选出适宜的继代培养基：金翠蕾为改良MS+6-BA0.5mg·L1+NAA0.1mg·L-1+D-生物素1.0mg·L-1,银翠蕾为改良MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.05+D-生物素1.0mg·L-1,白云则为改良MS+6-BA1.0mg·L1+IBA0.1mg-L-1+D-生物素0.5mg·L-1,平均增殖系数4.65；研究发现适当低温有利于诱导灰毡毛忍冬组培苗生根,找到了其组培苗生根培养的适宜温度为20℃；筛选出3个品种适宜的生根培养基是1/2MS+IBA3.0mg-L-1+AC210mg·L-1,平均生根率97.4%。同时以金翠蕾叶片为外植体,诱导出了愈伤组织和不定芽,筛选出了叶片诱导愈伤组织的最佳培养基为：B5+6-BA1.0mg·L-1+2,4-D0.5mg·L-1,愈伤组织诱导率为86.7%；诱导不定芽的最佳培养基为：B5+KT0.2mg·L1+NAA1.0mg·L-1,不定芽诱导率为73,4%。研究出组培苗“塑料杯单株一步移栽”技术,适宜移栽基质为黄心土+糠壳灰+细砂(1：2：2),平均移栽达成活率达95%以上。用凉开水替代蒸馏水,白砂糖代替蔗糖配制培养基,可显著降低了组培苗生产成本,提高了灰毡毛忍冬新品种工厂化育苗的生产效益。 (3)灰毡毛忍冬新品种组培苗扦插繁殖技术的研究。以灰毡毛忍冬新品种‘金翠蕾’组培苗为试验材料,开展了不同的扦插基质、扦插时期、植物生长调节剂、ABT6浓度及浸泡时间对灰毡毛忍冬新品种组培苗扦插繁殖的影响试验,研究结果表明,扦插基质以泥炭土+珍珠岩(体积比1：3)为宜,适宜的扦插时期是5月和9月,适宜的植物生长调节剂是300mg·L-1的ABT6浸泡插穗120min,扦插成活率达95%以上,大幅度降低了灰毡毛忍冬新品种组培苗生产成本。 (4)灰毡毛忍冬新品种组织培养过程内源激素变化的研究。以金翠蕾组培苗为试验材料,分析了组培苗增殖分化、生根及愈伤组织和不定芽诱导过程的内源激素含量变化,研究了6-BA浓度对继代培养组培苗、IBA浓度对生根培养组培苗内源激素含量的影响。结果表明：①灰毡毛忍冬组培苗继代增殖分化主要受内源ZR、ABA和GA3调控,较高浓度的ZR、GA3和较低ABA有利于灰毡毛忍冬组培苗继代增殖分化,适当高浓度的IAA对丛芽增殖分化和生长也有利,但作用不明显,而较高IPA含量有利于灰毡毛忍冬外植体启动培养,但与增殖分化关系不密切。内源激素平衡关系中是GA3/ZR值主导组培苗增殖分化,较高的GA3/ZR值有利于启动组培苗增殖分化和生长,而增殖分化盛期则需要较低的GA3/ZR值, GA3/ABA值也表现了类似效应。②在灰毡毛忍冬组培苗不定根的形成过程中,不同的内源激素对不定根形成的作用不同。较高浓度内源IAA、ABA和较低浓度的内源GA3、IPA、ZR有利于根原基的分化形成,促进了组培苗不定根的形成。而较高浓度的内源IAA、GA3、ZR、IPA和较低浓度的内源ABA有利于根原基的生长发育。内源激素的平衡关系也协同参与灰毡毛忍冬组培苗根原基分化形成及生长发育。较低的(ZR+IPA)/IAA值和较高的IAA/ABA、ABA/GA3值有利于根原基的分化形成,较高(ZR+IPA)/IAA值和较低ABA/GA3值有助于根原基生长发育。③不同的内源激素在灰毡毛忍冬愈伤组织和不定芽诱导过程中的作用不同。低浓度的内源GA3、IAA、ZR、ABA有利于愈伤组织的诱导,而高浓度的内源GA3、IAA、ZR促进了愈伤组织的生长。不定芽诱导主要受内源IAA和ABA调控,低水平的内源IAA、ABA、ZR、GA3含量有助于愈伤组织分化成不定芽。 (5)灰毡毛忍冬新品种组织培养过程多胺变化的研究。以金翠蕾组培苗为试验材料,分析了组培苗增殖分化、生根过程的内源多胺含量变化,研究了6-BA浓度对继代培养组培苗、IBA浓度对生根培养组培苗内源多胺含量的影响。结果表明：①不同的内源多胺在灰毡毛忍冬组培苗增殖分化过程中有不同效应。组培苗增殖分化主要与Spd、Put含量和Put/Spm值关系密切,与Spm含量和Put/Spd值、Put/(Spd+Spm)值关系不大；高水平的Spd、Put含量和Put/Spm值有利于组培苗增殖分化的启动,而增殖分化盛期则需要维持较低水平的Put、Spd含量和Put/Spm值。②Put、Spd、Spm及其平衡关系在灰毡毛忍冬组培苗根原基的分化形成与生长发育过程中的作用各异。高水平的Put、Spm含量和Put/Spd值、Put/(Spd+Spm)值有利于组培苗根原基的分化形成,而低水平的Put、Spm含量和Put/Spd值、Put/(Spd+Spm)值则促进根原基的生长发育。低水平的Spd含量和Put/Spm值,既可有利于组培苗根原基的分化形成,又可促进根原基生长发育。
【关键词】：灰毡毛忍冬 忍冬植物 ISSR 组织培养 激素 多胺
【学位授予单位】：中南林业科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：S567.79
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-19
• 1 绪论19-38
• 1.1 药用忍冬植物品种资源研究进展19-20
• 1.2 药用忍冬植物育种研究进展20-21
• 1.3 ISSR分子标记技术的研究进展21-24
• 1.3.1 ISSR分子标记技术的理论基础21-22
• 1.3.2 ISSR分子标记技术的基本反应程序22-23
• 1.3.3 ISSR分子标记技术的应用23-24
• 1.3.3.1 遗传作图构建及目的基因定位23-24
• 1.3.3.2 种质资源研究24
• 1.3.3.3 植物遗传多样性的分析24
• 1.4 药用忍冬植物分子生物学的研究进展24-27
• 1.4.1 药用忍冬植物DNA提取24-25
• 1.4.2 药用忍冬植物DNA染色体核型分析25-26
• 1.4.3 药用忍冬植物分子标记方法26
• 1.4.4 药用忍冬植物测序方法26
• 1.4.5 药用忍冬植物分子生物学研究存在的问题26-27
• 1.5 植物组织培养的理论基础27-28
• 1.6 药用忍冬植物组织培养的研究进展28-31
• 1.6.1 茎尖、茎段、芽的培养28-30
• 1.6.1.1 外植体28-29
• 1.6.1.2 初代培养29
• 1.6.1.3 继代培养29-30
• 1.6.1.4 生根培养30
• 1.6.1.5 炼苗与移栽30
• 1.6.2 叶片离体培养及愈伤组织诱导30-31
• 1.6.3 细胞培养31
• 1.6.4 药用忍冬植物组织培养存在的问题31
• 1.7 植物组织培养过程中内源激素的研究进展31-35
• 1.7.1 植物组织培养过程中内源激素研究的种类32
• 1.7.2 内源激素对培养物分化的调控32-33
• 1.7.3 内源激素在植物愈伤组织诱导中的作用33-34
• 1.7.4 外源激素与内源激素的关系34
• 1.7.5 内源激素在植物组织培养研究中存在的问题34-35
• 1.8 植物组织培养过程中内源多胺的研究进展35-38
• 1.8.1 内源多胺在植物体细胞胚胎发生中的作用35-36
• 1.8.2 内源多胺在植物愈伤组织诱导中的作用36
• 1.8.3 内源多胺在不定芽和不定根发生中的作用36-37
• 1.8.4 内源多胺在植物组织培养研究中存在的问题37-38
• 2 本课题研究概述38-41
• 2.1 课题的来源38
• 2.2 研究的目的意义38-39
• 2.3 研究的主要内容39-40
• 2.4 研究的技术路线40-41
• 3 灰毡毛忍冬新品种ISSR分子标记的研究41-62
• 3.1 材料与方法41-45
• 3.1.1 试验材料41-42
• 3.1.2 实验方法42-45
• 3.1.2.1 基因组DNA提取42-43
• 3.1.2.2 ISSR反应体系的建立与优化43-44
• 3.1.2.2.1 ISSR-PCR扩增43
• 3.1.2.2.2 ISSR反应程序43-44
• 3.1.2.2.3 扩增产物检测44
• 3.1.2.2.4 ISSR-PCR反应体系的优化试验设计44
• 3.1.2.3 引物筛选44
• 3.1.2.4 ISSR扩增44-45
• 3.1.3 数据统计及分析45
• 3.2 结果与分析45-60
• 3.2.1 药用忍冬植物基因组DNA提取45-47
• 3.2.1.1 DNA的不同提取方法对纯度和浓度的影响45-46
• 3.2.1.2 样品提取及检测46-47
• 3.2.2 ISSR反应体系建立与优化47-50
• 3.2.2.1 Taq DNA聚合酶单位对ISSR-PCR反应的影响47-48
• 3.2.2.2 dNTPs浓度对ISSR-PCR反应的影响48
• 3.2.2.3 引物浓度对ISSR-PCR反应的影响48-49
• 3.2.2.4 Mg~(2+)浓度对ISSR-PCR反应的影响49
• 3.2.2.5 模板DNA浓度对ISSR-PCR反应的影响49
• 3.2.2.6 退火温度对ISSR-PCR反应的影响49-50
• 3.2.2.7 优化的ISSR-PCR反应体系的建立50
• 3.2.3 ISSR引物筛选50-53
• 3.2.4 ISSR扩增53-56
• 3.2.5 ISSR多态性及指纹分析56
• 3.2.6 遗传相似性分析56-57
• 3.2.7 聚类分析57-59
• 3.2.8 主坐标分析59-60
• 3.3 小结与讨论60-62
• 4 灰毡毛忍冬新品种组织培养的研究62-87
• 4.1 材料与方法62-68
• 4.1.1 试验材料62
• 4.1.2 外植体消毒62
• 4.1.3 培养基与培养条件62
• 4.1.4 试验设计62-67
• 4.1.4.1 组织培养无菌体系的建立63
• 4.1.4.2 适宜继代培养基的筛选63-65
• 4.1.4.3 愈伤组织及不定芽的诱导65-66
• 4.1.4.4 适宜生根培养基的筛选66
• 4.1.4.5 组培苗移栽技术体系的建立66-67
• 4.1.4.6 降低组培生产成本试验67
• 4.1.5 数据统计分析67-68
• 4.2 结果与分析68-84
• 4.2.1 组织培养无菌体系的建立68-70
• 4.2.1.1 不同消毒处理对接种污染率及无菌外植体得率的影响68
• 4.2.1.2 不同时期的外植体对接种污染率及无菌外植体得率的影响68-69
• 4.2.1.3 初代培养基的激素配比对诱导外植体萌芽的影响69-70
• 4.2.2 适宜继代培养基的筛选70-76
• 4.2.2.1 基本培养基对丛生芽增殖的影响70
• 4.2.2.2 MS基本培养基大量营养元素含量对丛生芽增殖的影响70
• 4.2.2.3 细胞分裂素种类及浓度对丛生芽增殖的影响70-72
• 4.2.2.4 生长素种类及浓度对丛生芽增殖的影响72-74
• 4.2.2.5 D-生物素浓度对丛生芽增殖的影响74
• 4.2.2.6 蔗糖浓度对丛生芽增殖的影响74-75
• 4.2.2.7 丛生芽高效增殖优化培养基的筛选75-76
• 4.2.3 愈伤组织诱导及分化培养基筛选76-79
• 4.2.3.1 不同培养基和激素配比对愈伤组织诱导的影响76-77
• 4.2.3.2 不定芽的诱导77-79
• 4.2.3.3 再生植株产量与绿原酸79
• 4.2.4 适宜生根培养基的筛选79-81
• 4.2.4.1 不同生长素对组培苗生根的影响79
• 4.2.4.2 IBA浓度对组培苗生根的影响79-80
• 4.2.4.3 活性炭浓度对组培苗生根的影响80
• 4.2.4.4 温度对组培苗生根的影响80-81
• 4.2.4.5 不同品种对优化生根培养基的反应81
• 4.2.5 组培苗移栽技术体系的建立81-83
• 4.2.5.1 移栽基质的选择81-82
• 4.2.5.2 不同的杀菌剂及浸泡时间对组培苗移栽成活率的影响82
• 4.2.5.3 移栽容器对组培苗移栽成活率的影响82-83
• 4.2.6 降低组培生产成本试验83-84
• 4.2.6.1 白砂糖代替蔗糖配制培养基83
• 4.2.6.2 凉开水代替蒸馏水配制培养基试验83-84
• 4.3 小结与讨论84-87
• 5 灰毡毛忍冬新品种组培苗扦插繁殖的研究87-92
• 5.1 材料与方法87-88
• 5.1.1 试验材料87
• 5.1.2 试验方法87-88
• 5.1.2.1 扦插方法87
• 5.1.2.2 试验设计87-88
• 5.1.3 统计分析方法88
• 5.2 结果与分析88-91
• 5.2.1 扦插基质对灰毡毛忍冬新品种组培苗扦插生根的影响88-89
• 5.2.2 扦插时期对灰毡毛忍冬新品种组培苗扦插生根的影响89
• 5.2.3 植物生长调节剂种类对灰毡毛忍冬新品种组培苗扦插生根的影响89-90
• 5.2.4 ABT_6溶液浓度对灰毡毛忍冬新品种组培苗扦插生根的影响90
• 5.2.5 ABT_6浸泡时间对灰毡毛忍冬新品种组培苗扦插生根的影响90-91
• 5.3 小结与讨论91-92
• 6 灰毡毛忍冬新品种组织培养过程内源激素变化的研究92-109
• 6.1 材料与方法92-96
• 6.1.1 试验材料92
• 6.1.2 培养基与培养条件92
• 6.1.3 试验设计92-93
• 6.1.3.1 组培苗在不同继代培养周期的内源激素含量的变化92-93
• 6.1.3.2 6-BA浓度对继代培养组培苗的内源激素含量的影响试验93
• 6.1.3.3 IBA浓度对组培苗生根过程内源激素含量的影响试验93
• 6.1.3.4 组培苗生根过程内源激素含量的变化试验93
• 6.1.3.5 愈伤组织诱导过程内源激素含量的变化试验93
• 6.1.3.6 愈伤组织分化不定芽过程内源激素含量的变化试验93
• 6.1.4 内源激素的测定93-96
• 6.1.4.1 内源激素测定的种类93
• 6.1.4.2 内源激素测定的方法93-94
• 6.1.4.4 试剂的配制94
• 6.1.4.5 样品中激素的提取94
• 6.1.4.6 样品激素含量的测定94-95
• 6.1.4.7 内源激素计算方法95-96
• 6.1.5 统计分析方法96
• 6.2 结果与分析96-106
• 6.2.1 组培苗在不同继代培养周期的内源激素含量的变化96
• 6.2.2 组培苗在不同继代培养周期的内源激素平衡的变化96-97
• 6.2.3 组培苗在一个继代培养周期中的内源激素含量的变化97-98
• 6.2.4 组培苗在一个继代培养周期中的内源激素平衡的变化98
• 6.2.5 6-BA浓度对继代培养组培苗内源激素含量的影响98-100
• 6.2.6 IBA浓度对组培苗生根过程内源激素含量的影响100-104
• 6.2.6.1 IBA浓度对组培苗生根过程内源GA_3含量的影响100-101
• 6.2.6.2 IBA浓度对组培苗生根过程内源IAA含量的影响101
• 6.2.6.3 IBA浓度对组培苗生根过程内源ZR含量的影响101-102
• 6.2.6.4 IBA浓度对组培苗生根过程内源IPA含量的影响102
• 6.2.6.5 IBA浓度对组培苗生根过程内源ABA含量的影响102-103
• 6.2.6.6 IBA浓度对组培苗生根过程IAA/ABA值的影响103
• 6.2.6.7 IBA浓度对组培苗生根过程(ZR+IPA)/IAA值的影响103-104
• 6.2.6.8 IBA浓度对组培苗生根过程ABA/GA_3值的影响104
• 6.2.7 愈伤组织诱导过程内源激素含量的变化104-105
• 6.2.8 诱导愈伤组织分化不定芽过程内源激素含量的变化105-106
• 6.3 小结与讨论106-109
• 7 灰毡毛忍冬新品种组织培养过程内源多胺变化的研究109-117
• 7.1 材料与方法109-111
• 7.1.1 试验材料109
• 7.1.2 培养基与培养条件109
• 7.1.3 试验设计109-110
• 7.1.3.1 不同继代培养周期内源多胺含量的变化试验109
• 7.1.3.2 6-BA浓度对继代培养组培苗内源多胺含量的影响试验109-110
• 7.1.3.3 IBA浓度对组培苗生根过程内源多胺含量的影响试验110
• 7.1.3.4 组培苗生根过程内源多胺含量的变化试验110
• 7.1.4 多胺的测定110-111
• 7.1.4.1 仪器和试剂110
• 7.1.4.2 样品提取及纯化110
• 7.1.4.3 待测样品制作110
• 7.1.4.4 标准曲线制作110-111
• 7.1.4.5 色谱分析条件111
• 7.1.5 统计分析方法111
• 7.2 结果与分析111-115
• 7.2.1 组培苗在不同继代培养周期内源多胺含量及多胺平衡的变化111-112
• 7.2.2 组培苗在一个继代培养周期中内源多胺含量及多胺平衡的变化112
• 7.2.3 6-BA浓度对继代组培苗内源多胺含量的影响112-113
• 7.2.4 IBA浓度对组培苗生根过程内源多胺含量的影响113-114
• 7.2.4.1 IBA对组培苗生根过程内源腐胺含量的影响113-114
• 7.2.4.2 IBA对组培苗生根过程内源亚精胺含量的影响114
• 7.2.4.3 IBA对组培苗生根过程内源精胺含量的影响114
• 7.2.5 组培苗生根过程中内源多胺平衡的变化114-115
• 7.3 小结与讨论115-117
• 8 结论与创新117-120
• 8.1 结论117-118
• 8.2 创新点118-119
• 8.3 展望119-120
• 参考文献120-136
• 附录A136-138
• 附录B138-141
• 致谢141

【参考文献】

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  本文关键词：灰毡毛忍冬新品种ISSR分子标记及组织培养的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：391632