黄花蒿内生放线菌资源及其对黄花蒿生长和青蒿素生物合成的影响

发布时间：2017-06-30 19:21

  本文关键词：黄花蒿内生放线菌资源及其对黄花蒿生长和青蒿素生物合成的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】： 黄花蒿是一种重要的药用植物,其代谢产物青蒿素不仅是目前有效的抗疟药物,还具有抗病毒、抗肿瘤等其他的药用和农用价值;但由于青蒿素产量极低,严重限制了其应用范围。植物内生菌以其特殊的性质成为我们寻找替代药源和新活性物质的重要来源。本研究以采自昆明的黄花蒿为对象,分析其内生放线菌群落组成,从中发掘有应用潜力的菌种资源和新物种资源;并对内生放线菌与黄花蒿生长及青蒿素生物合成之间的关系进行了初步探讨。 本研究采用了四种方法进行黄花蒿内生放线菌的分离。首次将研磨珠均质器和干热处理运用于内生放线菌的分离。从黄花蒿全株样品中共分离获得内生放线菌228株。结合形态观察和16S rRNA基因序列分析,将全部分离菌株鉴定到属的水平,结果显示它们分别属于链霉菌属、原小单孢菌属、假诺卡氏菌属、诺卡氏菌属、野野村氏菌属、红球菌属、韩国生工菌属、小单孢菌属、马杜拉放线菌属、链孢囊菌属、拟无枝菌酸菌属、指孢囊菌属、芽生球菌属、糖霉菌属、考克氏菌属、微球菌属、戈登氏菌属、游动四孢菌属共18个已知属以及1个潜在新属。分离频率最高的是链霉菌,其次是原小单孢菌。 对其中6个候选新分类单元的代表菌株进行了包括形态与培养特征观察、生理生化特性、细胞化学组分分析、基因组DNA G+C mol%、DNA同源性和基于16S rRNA基因序列系统发育分析等在内的多相分类研究,确定了它们的分类地位。菌株YIM 65646是小单孢菌科的一个新属,被命名为植物单孢菌属(Plantmonospora gen. nov.),典型种为内生植物单孢菌(Plantmonospora endophytica sp. nov.)。菌株YIM 63111是假诺卡氏菌属的一个新种,被命名为珍贵假诺卡氏菌(Pseudonocardia pretiosum sp. nov.)。菌株YIM 65594、YIM 65638、YIM 65642代表了链霉菌属的一个新种,被命名为内生链霉菌(Streptomyces endophytica sp. nov.),典型菌株为YIM 65594。YIM 65601为野野村氏菌属的一个新种,被命名为内生野野村氏菌(Nonomuraea endophytica)。 以上研究结果充分显示黄花蒿体内蕴藏着大量丰富的放线菌菌种资源,其中也包括许多未被发掘的新物种资源。在此基础上,我们对这些内生放线菌的抗菌、酶活、除草活性及产生聚酮类和非核糖体多肽类物质的潜力进行了检测。 采用琼脂扩散法进行抗菌活性检测,在228株内生放线菌中有15.8%～34.6%的菌株分别对指示菌(金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、玉蜀黍长蠕孢菌、燕麦镰孢菌、炭疽病菌、苹果腐烂病菌)具有抑制活性,其中有31株菌(13.6%)表现出较强的广谱抗菌活性。 采用PCR扩增法对166株菌进行了PKS-I,PKS-II和NRPS基因的测定,获得35株(21.1%)PKS-I基因阳性的菌株,75株(45.2%)PKS-II基因阳性的菌株,扩增出NRPS基因的有54株(32.5%)。 用平板筛选的方法,对199株菌进行了酶活检测,从中筛选到7株淀粉酶活性较强的菌株,10株蛋白酶活性较强的菌株,1菌株具有较强的脂肪酶活性(菌落边缘至透明圈边缘的距离0.5cm);7株纤维素酶活性较强的菌株(菌落边缘至透明圈边缘的距离≥1.0cm)。 选取117株代表性菌株,对其发酵液进行稗草萌发的抑制活性检测,其中有19株菌(16.2%)能完全抑制稗草发芽。 首次对黄花蒿内生放线菌资源进行系统的活性评价,研究结果证实了内生放线菌确实是一类具有天然产物开发潜力的重要资源。从中我们也获得了一批值得后续研究的菌株。 通过回接实验发现,32个菌株对黄花蒿幼苗的生长表现出了不同的影响。大多数菌株不影响幼苗的生长;其中6个菌株对幼苗的生长有一定的促进作用;4株菌对黄花蒿幼苗的生长表现出抑制作用,其中菌株YIM 63111的抑制作用最为强烈。 开展了回接处理后,青蒿素合成途径中相关基因表达水平的定量分析,以及青蒿素含量的检测。结果表明在一定回接处理浓度下,菌株YIM 63111能诱导无菌培养条件下和温室培养条件下生长的黄花蒿植株的CYP71AV1和CPR基因表达水平显著上调,使青蒿素含量提高了30%～40%。这是首次发现内生放线菌对青蒿素的生物合成有诱导作用。 首次采用egfp标记内生的假诺卡氏菌YIM 63111,进行回接定殖研究。结果显示在回接14天后,该菌株在黄花蒿幼苗根表面和内部均有定殖。 本研究揭示了黄花蒿内生放线菌的部分生物学和生态学特性,对于开发内生放线菌的活性代谢产物,认识内生菌与植物之间的关系,利用内生放线菌促进黄花蒿的生长、提高青蒿素含量具有一定的指导作用。
【关键词】：黄花蒿 内生放线菌 多样性 生物活性 青蒿素 回接实验
【学位授予单位】：云南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：S567.219
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 第一章 研究背景及选题依据13-35
• 1 植物内生菌概述13-15
• 2 内生放线菌研究现状15-30
• 2.1 内生放线菌物种多样性16-20
• 2.2 内生放线菌代谢产物研究20-23
• 2.3 内生放线菌生态学特性研究23-30
• 2.4 内生放线菌的应用价值30
• 3 黄花蒿及其内生菌30-33
• 3.1 黄花蒿药用价值30-31
• 3.2 提高青蒿素产量的生物技术途径31-32
• 3.3 黄花蒿内生菌研究现状32-33
• 4 本研究的目的意义及思路33-35
• 第二章 黄花蒿内生放线菌分离及初步鉴定35-49
• 1 材料与方法35-39
• 1.1 植物材料35
• 1.2 清洗植物样品35
• 1.3 表面消毒35-36
• 1.4 分离培养基36
• 1.5 分离程序36-37
• 1.6 菌株的初步归类37
• 1.7 基因组DNA 提取37
• 1.8 16S rRNA 基因的扩增及测序37-38
• 1.9 基于16S rRNA 基因序列的系统发育分析38-39
• 2 结果与讨论39-48
• 2.1 表面消毒效果的检验39
• 2.2 黄花蒿内生放线菌资源的物种组成分析39-43
• 2.3 部分菌株序列相似性分析43-45
• 2.4 分离效果的比较45-48
• 3 本章小结48-49
• 第三章 潜在新分类单元的多相分类49-94
• 1 材料与方法49-64
• 1.1 实验菌株49
• 1.2 形态和培养特征49-50
• 1.3 生理生化特征50-51
• 1.4 化学分类特征51-62
• 1.5 分子分类62-64
• 2 结果分析64-93
• 2.1 假诺卡氏菌属一个新种的多相分类研究64-69
• 2.2 小单孢菌科一个新属的多相分类研究69-78
• 2.3 链霉菌属一个新种的多相分类研究78-86
• 2.4 野野村氏菌属一个新种的多相分类研究86-93
• 3. 本章小结93-94
• 第四章 黄花蒿内生放线菌的生物活性94-116
• 1 材料与方法94-97
• 1.1 实验菌株94-95
• 1.2 病原指示菌、植物种子95
• 1.3 菌株发酵95
• 1.4 抑菌检测95
• 1.5 PKS 和NRPS 基因测定95-96
• 1.6 酶活检测96-97
• 1.7 稗草种子萌发抑制作用初测97
• 2 结果与讨论97-115
• 2.1 抗菌活性97-102
• 2.2 PKS 和NRPS 基因的测定结果102-106
• 2.3 产酶能力测定106-113
• 2.4 稗草种子萌发抑制作用113-115
• 3 本章小结115-116
• 第五章 内生放线菌对黄花蒿幼苗生长的影响116-124
• 1 材料与方法116-118
• 1.1 供试菌株116
• 1.2 黄花蒿幼苗的培养116-118
• 1.3 内生放线菌的回接118
• 1.4 生长参数测定118
• 1.5 回接菌株再分离实验118
• 2 结果与讨论118-123
• 2.1 回接菌株生长情况118
• 2.2 菌株再分离实验118-120
• 2.3 回接菌株对黄花蒿幼苗生长的影响120-123
• 3 本章小结123-124
• 第六章 黄花蒿内生放线菌对青蒿素生物合成的影响及回接定殖初探124-146
• 1 材料与方法125-129
• 1.1 青蒿素提取及检测125-126
• 1.2 菌株YIM 63654 和YIM 63673 回接无菌培养黄花蒿幼苗126
• 1.3 菌株YIM 63111 回接无菌培养黄花蒿幼苗126
• 1.4 菌株YIM 63111 回接温室培养黄花蒿幼苗126
• 1.5 Real Time RT-PCR126-127
• 1.6 相对定量数据分析127-128
• 1.7 显微观察128
• 1.8 构建egfp 标记的菌株YIM 63111128
• 1.9 回接观察egfp 标记的菌株YIM 63111128-129
• 2 结果与分析129-142
• 2.1 第一轮实验中青蒿素含量检测结果129
• 2.2 第二次回接实验中菌株再分离结果129-130
• 2.3 菌株YIM 63654 和YIM 63673 回接处理对青蒿素积累的影响130
• 2.4 菌株YIM 63111 对青蒿素生物合成的影响130-137
• 2.5 扫描电镜观察菌株YIM 63111 定殖情况137-139
• 2.6 构建egfp 标记的菌株YIM 63111 并观察其定殖情况139-142
• 3 讨论142-145
• 4 本章小结145-146
• 总结与展望146-148
• 参考文献148-169
• 附录169-177
• 攻读博士学位期间的成果目录177-181
• 致谢181

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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3 沈月毛,甘烦远,杜良成,郝小江;多酮类化合物的生物合成[J];化学进展;2000年04期

4 曾庆平;赵昌;尹录录;杨瑞仪;曾晓梅;黄瑛;冯丽玲;杨雪芹;;青蒿素合成cDNA和新EST的克隆及其低温诱导表达的定量分析[J];中国科学(C辑:生命科学);2008年02期

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本文编号：503228