胎牛皮脱细胞真皮基质在组织工程中的应用

发布时间：2017-07-19 02:04

  本文关键词：胎牛皮脱细胞真皮基质在组织工程中的应用

  更多相关文章： 胎牛皮 脱细胞真皮基质 组织修复 组织工程支架 皮肤细胞 骨髓间充质干细胞 软骨分化 神经分化

【摘要】：应用组织工程技术构建自体来源的新生组织或器官以修复损伤的组织器官一直是再生医学研究领域的一个梦想。将适宜的种子细胞在生物支架材料上培养和诱导，以构建组织工程化的组织或器官（Tissue Engineered tissue or organ），修复组织损伤和器官缺损是再生医学领域的研究重点，而生物支架材料又是组织工程研究的三大要素之一。脱细胞真皮基质是去除皮肤组织中抗原性很强的细胞成分包括表皮、皮肤的附属器（毛囊、皮脂腺、汗腺）和真皮内的血管内皮细胞、成纤维细胞等及皮下脂肪组织后，所剩余的免疫原性相对较弱的细胞外基质及真皮层的胶原纤维网状结构。人皮、猪皮脱细胞真皮基质已广泛用于医学临床的烧伤和创伤修复领域，产生了很好的治疗效果，但受其来源、宗教、价格等方面的限制，使用有一定局限性。因生物制药对胎牛血清的大量需求，导致了很多胎牛皮副产物被废弃。胎牛皮真皮的组织结构与人真皮相似，是天然的生物支架材料。由于胎牛处于生长发育阶段，胎牛皮（特别是3~5月龄的胎牛皮）的毛囊发育不完善，组成真皮的胶原纤维主要是胶原原纤维，与人皮或猪皮相比，其抗原性成分更易除去，其基质成分更易被机体组织细胞作为营养物质吸收。因此，研究胎牛皮脱细胞真皮基质（FBADM）的制备及其作为组织工程的生物支架和损伤修复的生物敷料，不仅可为胎牛皮的合理开发利用提供理论依据，而且可变废为宝，，为组织工程和医学临床提供大量优质的天然生物支架材料，对促进胎牛皮的合理开发利用和我国再生医学的发展具有重要的现实意义和实际应用价值。 本文以3~5月龄胎牛皮制备FBADM，在确定抗原成分被去除后，用FBADM作为三维生物支架，分别以非洲绿猴肾细胞、婴儿皮肤细胞和人骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）为种子细胞，进行体外复合培养，并进一步对复合培养的BM-MSCs进行软骨、神经分化诱导，研究FBADM的生物相容性和作为组织工程生物支架材料的可能性及其在干细胞培养、组织工程皮肤、软骨和神经构建中的应用前景。本论文试验研究分为五部分： 第一部分主要研究FBADM的表征与结构。结果显示：以3~5月龄胎牛皮制备的FBADM在水中呈乳白色，丝绸般柔软、柔韧而富有弹性，具有生物力学性能，耐撕扯和适宜外科手术缝合。扫描电镜显示：FBADM厚度在60~200μm之间，由4~6层胶原纤维网状结构构成。脱细胞处理可能会导致真皮乳头层的表面基底膜发生损伤。在基底膜损伤处胶原纤维纵横交错；在基底膜完整的部位，表面有3~10μm的孔状结构；真皮皮下组织面呈纤细的胶原纤维网状。石蜡切片H.E染色显示：FBADM主要由胶原纤维构成，无细胞碎片和细胞核物质残留，DNA残留检测阴性，说明抗原性异物处理的干净、彻底。 第二部分主要研究FBADM与异种动物的体内生物相容性。分别将1cm2大小的FBADM灭菌、复水后，埋植于威斯特大鼠和昆明小白鼠的背部皮下，饲养观察，检测FBADM对动物的急性毒性和与异种动物的生物相容性。结果：埋植后饲养观察35d，两种试验动物生命体征和饮食正常，未发生急性毒性反应。35d后，解剖部分大鼠和小鼠，制备石蜡切片，观察显示有大量成纤维细胞长入FBADM中，局部有微血管形成，FBADM基质周围未见炎性细胞聚集。提示：在大鼠和小鼠体内，FBADM具有良好的生物相容性，并可促进毛细血管的生成，无免疫排斥反应发生。 第三部分主要研究FBADM与异种动物细胞的体外生物相容性和其作为细胞培养支架进行三维立体培养的可能性。结果显示：不论在FBADM周围，还是在FBADM表面及其内部网状组织结构中，非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）均能良好生长、增殖，细胞形态正常。经3~4次胰蛋白酶消化处理后，Vero细胞仍能在FBADM上良好生长。说明FBADM对异种动物肾细胞细胞无毒性而有良好的生物相容性，对胰蛋白酶的消化具有一定的耐受性，可作为体外细胞三维培养的支架材料。 第四部分主要研究FBADM在皮肤组织工程领域的应用。以FBADM为组织工程皮肤支架，并人为将基质剪开、造成损伤后，将婴儿皮肤细胞种植于FBADM上，进行体外复合培养，观察细胞生长和损伤基质的修复。结果：扫描电镜和石蜡切片均显示：皮肤细胞在FBADM表面和内部网状组织中均能良好生长、增殖，并在10d内有新生血管生成；人为剪开的基质缺损，在体外复合培养35~56d后，完全长到了一起。表明FBADM与婴儿皮肤细胞不仅有良好的生物相容性，而且可诱导血管的形成，是构建组织工程皮肤的良好支架材料，也可促进组织损伤的修复。 第五部分主要研究FBADM作为骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）体外培养和分化诱导培养支架的可能性及BM-MSCs在FBADM上的软骨和神经分化。结果：倒置相差显微镜、扫描电镜、石蜡切片、激光共聚焦显微镜和免疫荧光染色等技术监测显示：将BM-MSCs种植于FBADM上，用HyClone STEM Basal Media（BM）进行三维复合培养，细胞能够良好生长和增殖，8~34d可自然形成血管和神经样分化结构；45d后，细胞在FBADM上形成了复杂的多层结构；而FBADM原有的相对较粗大、致密的胶原纤维束变得纤细而弯曲。提示在细胞生长增殖的过程中，基质中的胶原纤维可被降解和吸收利用；经软骨分化培养基（CDM）诱导分化培养后，细胞能够在FBADM上增殖，产生大量基质纤维，经软骨基质特异性甲苯胺蓝染色，呈淡红色异染的阳性反应；用神经分化培养基(NDM)诱导分化培养后，形成了抗神经元特异性抗体染色阳性、具有典型的两级和多极神经元形态的细胞，复合培养物表面分化细胞形成了纵横交错的神经网络和神经信号回路。提示了BM-MSCs能够在FBADM上增殖并可向软骨细胞和神经细胞分化，FBADM可作为BM-MSCs培养和软骨与神经分化诱导培养的生物支架。 结论：胎牛皮脱细胞真皮基质具有良好的生物相容性，可作为异种动物细胞和干细胞培养的生物支架，培养婴儿皮肤细胞和骨髓间充质干细胞，有利于细胞的增殖，并可促进细胞向血管和神经细胞分化，可作为组织工程皮肤、软骨和神经构建的支架材料，在组织工程皮肤、软骨与神经构建中具有广阔的应用前景。
【关键词】：胎牛皮 脱细胞真皮基质 组织修复 组织工程支架 皮肤细胞 骨髓间充质干细胞 软骨分化 神经分化
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 摘要4-7
• Summary7-18
• 第一部分 文献综述18-32
• 一、组织工程概述18-21
• 二、骨髓间充质干细胞21-23
• 三、生物支架材料23-24
• 四、脱细胞真皮基质的优势24-25
• 五、组织工程的研究现状25-30
• 1. 组织工程支架研究进展25-27
• 2. 组织工程的种子细胞研究进展27-28
• 3. 组织器官构建的研究进展28-30
• 4. 组织工程化组织与器官在临床上的挑战30
• 六、课题的提出30-32
• 第二部分 试验研究32-99
• 前言32-35
• 第一章 FBADM 的表面特征与结构35-43
• 引言35
• 1. 材料与方法35-36
• 1.1 材料与设备35
• 1.2 试验方法35-36
• 1.2.1 外观特征35
• 1.2.2 结构测定35-36
• 1.2.2.1 石蜡切片制备与 H.E 染色35
• 1.2.2.2 扫描电镜观察35
• 1.2.2.3 透视电镜观察35
• 1.2.2.4 DNA 残留提取35-36
• 1.2.3 保存与灭菌36
• 1.2.3.1 冷冻干燥保存36
• 1.2.3.2 Co~(60)辐照灭菌36
• 1.2.3.3 冷冻干燥及辐照灭菌后的复水效果36
• 2. 结果36-41
• 2.1 外观特征观察36-37
• 2.2 结构检测结果37-40
• 2.2.1 石蜡切片及 H.E 染色的结果37-38
• 2.2.2 扫描电镜下的形态与结构38-39
• 2.2.3 透视电镜观察39
• 2.2.4 DNA 残留39-40
• 2.3 保存与灭菌40-41
• 2.3.1 冷冻干燥40
• 2.3.2 复水软化40
• 2.3.3 Co~(60)辐照灭菌剂量确定40-41
• 3. 分析讨论41-42
• 4. 结论42-43
• 第二章 FBADM 的生物相容性43-55
• 引言43
• 第一节 实验动物体内埋植试验43-46
• 1. 材料与方法43-44
• 1.1 试验材料43-44
• 1.1.1 埋植材料43-44
• 1.1.2 实验动物44
• 1.1.3 其它44
• 1.2 试验方法44
• 1.2.1 材料的准备44
• 1.2.2 皮下埋植44
• 1.2.3 观测44
• 2. 试验结果44-45
• 2.1 活体观察44
• 2.2 石蜡切片观察44-45
• 3. 分析讨论45-46
• 4. 结论46
• 第二节 FBADM 的体外细胞相容性46-55
• 1. 材料与方法46-48
• 1.1 材料46-47
• 1.1.1 试验材料46-47
• 1.1.2 试验设备47
• 1.2 试验方法47-48
• 1.2.1 试验用 FBADM 的准备47
• 1.2.2 准备细胞悬液47
• 1.2.3 细胞接种与培养47
• 1.2.4 细胞生长监测47-48
• 1.2.4.1 细胞生长曲线和细胞活力测定47-48
• 1.2.4.2 细胞形态观察48
• 2. 结果48-52
• 2.1 细胞的生长增殖48-49
• 2.2 细胞的活力检测49-50
• 2.3 细胞形态观察50-52
• 3. 分析讨论52-54
• 4. 结论54-55
• 第三章 FBADM 作为皮肤组织工程支架的研究55-63
• 引言55-57
• 1. 材料与方法57-58
• 1.1 材料与设备57
• 1.1.1 试验材料57
• 1.1.2 试验仪器和设备57
• 1.2 试验方法57-58
• 1.2.1 FBADM 的准备57
• 1.2.2 制备细胞悬液57
• 1.2.3 接种细胞57
• 1.2.4 观察与检测57-58
• 2. 结果58-61
• 2.1 FBADM 对细胞生长的影响58-59
• 2.2 FBADM 与损伤愈合59
• 2.3 FBADM 与血管形成59-61
• 3. 分析讨论61-62
• 4. 结论62-63
• 第四章 FBADM 作为干细胞培养支架的研究63-73
• 引言63-64
• 1. 材料与方法64-66
• 1.1 材料与设备64-65
• 1.1.1 试验材料64-65
• 1.1.2 试验设备65
• 1.2 试验方法65-66
• 1.2.1 hBM-MSCs 细胞的复苏65
• 1.2.2 hBM-MSCs 细胞的分化特性鉴定65-66
• 1.2.3 hBM-MSCs 在 FBADM 上的增殖培养66
• 1.2.3.1 FBADM 的准备66
• 1.2.3.2 细胞接种66
• 1.2.3.3 细胞生长监测66
• 2. 结果66-70
• 2.1 复苏后 hBM-MSCs 的分化特性66-68
• 2.2 hBM-MSCs 在 FBADM 上的增殖与分化68-70
• 3. 分析讨论70-72
• 4. 结论72-73
• 第五章 hBM-MSCs 在 FBADM 上软骨分化诱导73-84
• 引言73-75
• 1. 材料与方法75-77
• 1.1 材料与设备75
• 1.1.1 试验材料75
• 1.1.2 试验设备75
• 1.2 试验方法75-77
• 1.2.1 24 孔板培养法76
• 1.2.1.1 细胞悬液制备76
• 1.2.1.2 FBADM 准备76
• 1.2.1.3 细胞接种与分化诱导76
• 1.2.2 离心管深层培养法76
• 1.2.2.1 离心管准备76
• 1.2.2.2 细胞的准备76
• 1.2.2.3 细胞的接种与分化诱导76
• 1.2.4 细胞生长检测76-77
• 2. 结果77-81
• 2.1 平板培养法77-80
• 2.2 离心管深层培养法80-81
• 3. 分析讨论81-83
• 4. 结论83-84
• 第六章 BM-MSCs 在 FBADM 上神经分化诱导84-99
• 引言84-86
• 1. 材料与方法86-88
• 1.1 材料与设备86
• 1.1.1 试验材料86
• 1.1.2 试验设备86
• 1.2 方法86-88
• 1.2.1 BM-MSCs 的复苏与分化特性86
• 1.2.2 FBADM 的准备86-87
• 1.2.3 细胞接种与增殖培养87
• 1.2.4 神经分化诱导培养与控制87
• 1.2.5 免疫荧光染色87
• 1.2.6 扫描电子显微镜样品准备87-88
• 1.2.7 石腊切片88
• 1.2.8 SPSS 统计软件88
• 2. 结果88-96
• 2.1 倒置相差显微镜的观察结果88-90
• 2.2 免疫荧光染色90-91
• 2.3 SEM 观察结果91-93
• 2.4 石蜡切片93-94
• 2.5 SPSS 分析结果94-96
• 3. 分析讨论96-97
• 4. 结论97-99
• 全文主要结论99-100
• 参考文献100-116
• 作者简介116
• 在读期间发表论文和研究成果116-117
• 导师简介117-118
• 致谢118

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

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本文编号：560710