麦长管蚜翅型分化相关的生态学及microRNA水平的分子机理研究

发布时间：2017-07-29 10:09

  本文关键词：麦长管蚜翅型分化相关的生态学及microRNA水平的分子机理研究

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【摘要】：蚜虫是研究翅二型性的理想模式昆虫,可结合遗传因素和环境因素变化研究翅分化机制。由于外界环境因子的影响,蚜虫在发育过程中呈现两种不同的生物型,有翅蚜和无翅蚜。这种表观形态的变化主要是由于受到环境因子的胁迫,通过选择性地表达基因从而达到了调控的作用,这属于典型的表观遗传学范畴。micro RNA(mi RNA)作为重要的后转录水平调控因子,参与生物生长发育的各个生命过程,是表观遗传学的重要研究内容。随着近年来大量昆虫mi RNAs的鉴定,明确其在昆虫生长发育中的作用已成为新的研究热点,而且从mi RNA角度对昆虫翅发育的研究也取得了一些进展。因此,开展麦长管蚜翅型分化相关的生态学及mi RNA水平的分子机理方面的研究,为解析麦蚜的翅型分化机理奠定一定的理论基础。本研究利用体视显微镜、扫描电镜技术对麦长管蚜不同翅型不同龄期成若蚜的形态测量学和外部形态特征进行研究;通过设定不同的外界因子,对麦长管蚜翅型分化的生态学进行研究;运用高通量测序和q RT-PCR等技术,对麦长管蚜翅型分化的mi RNA调控机理方面进行了研究。主要得到以下研究结果:首先对麦长管蚜不同翅型不同龄期成若蚜的形态测量学和外部形态特征进行研究,结果表明麦长管蚜1、2龄若蚜外部形态无明显差别,触角均为5节;3龄有翅若蚜中胸发达,可见初生翅芽,至成虫期发育为完整的翅;3龄无翅若蚜中胸结构简单,未见翅芽,3龄至成蚜触角均为6节;1龄若蚜尾片呈瘤状,着生2根刚毛;2、3、4龄若蚜尾片呈圆锥形;有翅成蚜尾片呈长锥形,无翅成蚜呈长舌状,2龄若蚜至成蚜尾片均着生6根以上刚毛;1龄到3龄若蚜腹管的外部形态基本相似,呈圆柱状,4龄若蚜腹管端部开始膨大,近端部变细。有翅成蚜和无翅成蚜腹管基本无差异,与若蚜相比,近顶端表面均呈现多角形网状结构。通过设定不同的拥挤度、温度、母代效应、寄主营养等因素,观察对麦长管蚜翅型分化影响。结果表明初产若蚜的拥挤度越大,越有利于其形成有翅个体;较高的温度和较低的温度处理条件下,均有利于麦长管蚜初龄若蚜有翅蚜的形成;拥挤处理母代,对后代个体的翅型分化存在影响,处理不同翅型的母代对后代个体翅型分化也存在差异;寄主营养不仅影响当代若蚜表型的变化,同样影响第二代的表型变化。通过构建麦长管蚜有翅成蚜和无翅成蚜的mi RNAs文库,利用高通量测序技术及生物信息学分析方法,测序结果中一共得到了146个保守的mi RNAs,152个新的mi RNAs,且34%以上的mi RNAs的长度分布在22nt,这符合典型的mi RNAs长度分布。采用数据归一化和差异检验方法(P值小于0.1、0.05以及0.01),筛选出52个表达差异显著mi RNAs,其中30个上调控的mi RNAs和22个下调控的mi RNAs。通过预测差异表达的mi RNAs的靶基因,利用基因本体论GO、KEGG信号通路分析,初步筛选出可能与麦长管蚜翅型分化相关的9个mi RNAs,包括7个保守的mi RNAs(Let-7、mi R-1_L-1、mi R-7、mi R-277、mi R-8、m R-9a_R-2和mi R-315)和2个新的mi RNAs(PC-5p-113190_15和PC-3p-2743_844)。通过q RT-PCR技术分析9个mi RNAs在两翅型中的表达谱,结果表明9个mi RNAs在有翅成蚜中的表达量均高于无翅成蚜中的表达量,且有5个保守的mi RNAs(Let-7、mi R-1_L-1、mi R-7、mi R-277和mi R-8)的表达量差异显著,推测这些mi RNAs可能在麦长管蚜的翅型发育中起重要调控作用。通过构建麦长管蚜翅型分化敏感期(有翅蚜和无翅蚜的伪胚胎、1龄和2龄)的mi RNAs文库,经过初步过滤筛选得到60%的clean数据可用于后续的生物信息学分析。预测得到保守的pre-mi RNA 85个,unique-mi RNA 150个,新预测得到的新的pre-mi RNA 1050个,unique mi RNA 1016个。通过差异检验方法对两两数据库进行差异比对,发现大量差异表达的mi RNAs。将预测得到的保守的mi RNAs与其他昆虫的mi RNAs进行保守性分析,表明其与邻近物种豌豆蚜Acyrthosiphon pisum保守性较高,其次是赤拟谷盗Tribolium castaneum和家蚕Bombyx mori。通过q RT-PCR技术对9个mi RNAs在两翅型不同龄期的表达谱进行分析,表明不同mi RNAs在麦长管蚜不同的翅型和不同发育阶段的相对表达量不同,进一步地揭示mi RNAs表达的特异性和时序性。选择两个前期预测得到的可能与麦长管蚜的翅型分化相关mi RNAs(mi R-7和mi R-277),根据mi RNA的成熟序列设计,人工合成双链小RNA(mi RNA agomir),通过模拟体内mi RNA,与靶基因相互配对,增强mi RNAs在体内的表达。用人工饲料将mi RNA agomir稀释至300 n M,将单头饲养三代的无翅成蚜初产24 h内的若蚜,每10头放入含有相应mi RNA agomir的饲蚜器中饲喂不同的时间。运用q RT-PCR技术检测mi RNA agomir的过表达效应,结果表明,与对照相比,随着饲喂时间的延长,目的基因mi R-7和mi R-277的表达量也随着增加。将饲喂不同时间的若蚜,单头单株接入到新鲜的盆栽麦株上。4-5天后,观察发现处理后的若蚜均能够正常生长,未观察到麦长管蚜若蚜翅型分化比例的变化。
【关键词】：麦长管蚜 翅型分化 环境因素 microRNA 高通量测序
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S435.12
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-22
• 英文缩略表22-23
• 第一章 引言23-39
• 1.1 昆虫翅发育的研究进展24-27
• 1.2 影响蚜虫翅型分化的因子27-29
• 1.2.1 外界因子27-28
• 1.2.2 内部因子28-29
• 1.3 MicroRNA的研究概况29-32
• 1.3.1 MiRNA的作用机制31
• 1.3.2 MiRNA的研究方法31-32
• 1.4 MiRNA在昆虫中的研究32-35
• 1.5 MiRNA在昆虫翅型分化上的研究35-37
• 1.6 研究目的和意义37
• 1.7 研究内容与拟解决的关键问题37
• 1.7.1 研究内容37
• 1.7.2 拟解决的关键问题37
• 1.8 技术路线37-39
• 1.8.1 外界因子对麦长管蚜翅型分化的影响37-38
• 1.8.2 MiRNA对麦长管蚜翅型分化的研究38-39
• 第二章 麦长管蚜两翅型外部形态的比较39-52
• 2.1 试验材料39-40
• 2.1.1 供试昆虫39
• 2.1.2 饲养皿的制备39
• 2.1.3 主要实验仪器39-40
• 2.2 试验方法40
• 2.2.1 形态学测量40
• 2.2.2 扫描电镜样品的制备40
• 2.3 统计分析40
• 2.4 结果与分析40-49
• 2.4.1 麦长管蚜有翅型与无翅型各龄期若蚜及成蚜形态测量比较40-43
• 2.4.2 麦长管蚜不同龄期若蚜及成蚜中胸外部形态的比较43
• 2.4.3 麦长管蚜不同龄期若蚜及成蚜触角外部形态比较43-45
• 2.4.4 麦长管蚜不同龄期若蚜及成蚜尾片外部形态的比较45
• 2.4.5 麦长管蚜不同龄期若蚜及成蚜腹管外部形态的比较45-49
• 2.5 结论与讨论49-51
• 2.5.1 麦长管蚜两翅型各龄期若蚜及成蚜形态测量学研究49
• 2.5.2 麦长管蚜两翅型各龄期若蚜及成蚜外部形态的研究49-51
• 2.6 小结51-52
• 第三章 外界因子对麦长管蚜翅型分化的影响52-66
• 3.1 试验材料52-53
• 3.1.1 供试昆虫52
• 3.1.2 饲养皿的制备52
• 3.1.3 全人工饲料配制52
• 3.1.4 饲蚜器的制备52-53
• 3.2 主要试剂和仪器53
• 3.3 试验方法53-55
• 3.3.1 拥挤效应53
• 3.3.2 温度效应53
• 3.3.3 母代效应53-54
• 3.3.4 营养效应54-55
• 3.4 数据处理55
• 3.5 结果与分析55-64
• 3.5.1 不同拥挤度对麦长管蚜初产若蚜翅型分化的影响55
• 3.5.2 温度对麦长管蚜初产若蚜翅型分化的影响55-57
• 3.5.3 母代效应对麦长管蚜若蚜翅型分化的影响57-58
• 3.5.4 寄主营养对麦长管蚜翅型分化的影响58-64
• 3.6 结论与讨论64-65
• 3.7 小结65-66
• 第四章 麦长管蚜有翅成蚜和无翅成蚜miRNAs的深度测序66-90
• 4.1 试验材料66-67
• 4.1.1 供试昆虫66
• 4.1.2 主要数据库及软件66-67
• 4.1.3 主要试剂和仪器67
• 4.2 试验方法67-70
• 4.2.1 总RNA样本的提取67
• 4.2.2 麦长管蚜miRNAs文库的构建和高通量测序67-68
• 4.2.3 MiRNAs生物信息学分析68
• 4.2.4 MiRNAs二级结构的预测68-69
• 4.2.5 两样本miRNAs的差异分析69
• 4.2.6 靶基因功能的预测和Pathway分析69-70
• 4.2.7 翅型分化相关miRNAs的筛选70
• 4.3 结果与分析70-87
• 4.3.1 RNA样品质量检测70-71
• 4.3.2 麦长管蚜miRNAs高通量测序及生物信息学分析71-75
• 4.3.3 麦长管蚜两翅型miRNAs的鉴定75-76
• 4.3.4 麦长管蚜两翅型中差异基因的筛选76-78
• 4.3.5 麦长管蚜两种翅型miRNAs的核酸偏移性分析78
• 4.3.6 麦长管蚜两个文库中miRNAs的保守性分析78-80
• 4.3.7 麦长管蚜两翅型中miRNAs的靶标预测80-82
• 4.3.8 翅型分化相关的miRNAs的筛选及同源性分析82-87
• 4.4 结论与讨论87-88
• 4.4.1 麦长管蚜的miRNAs的一般特征87
• 4.4.2 麦长管蚜保守的miRNAs和新的miRNAs87-88
• 4.4.3 MiRNAs的功能及靶标预测88
• 4.4.4 与翅型分化相关的miRNAs的筛选88
• 4.5 小结88-90
• 第五章 麦长管蚜翅型分化相关miRNAs的克隆及表达谱分析90-113
• 5.1 试验材料90-93
• 5.1.1 供试昆虫90
• 5.1.2 数据来源90-91
• 5.1.3 主要试剂91
• 5.1.4 主要溶液配置91
• 5.1.5 主要仪器设备91-92
• 5.1.6 引物设计92-93
• 5.2 试验方法93-98
• 5.2.1 总RNA的提取93-94
• 5.2.2 总RNA的检测94
• 5.2.3 cDNA的合成94
• 5.2.4 RT-PCR反应体系94-96
• 5.2.5 PCR产物的回收96
• 5.2.6 连接转化96
• 5.2.7 PCR鉴定阳性克隆及序列测定96-97
• 5.2.8 qRT-PCR定量分析97-98
• 5.2.9 荧光定量标准曲线的制作98
• 5.2.10 荧光定量PCR数据分析98
• 5.3 结果与分析98-111
• 5.3.1 总RNA的提取98-99
• 5.3.2 MiRNA成熟序列的克隆99-100
• 5.3.3 内参U6的克隆与序列分析100-102
• 5.3.4 9 个miRNAs及内参U6上机检测引物的特异性102-108
• 5.3.5 9 个miRNAs在两翅型中的表达谱分析108-111
• 5.4 结论与讨论111-112
• 5.5 小结112-113
• 第六章 有翅和无翅若蚜miRNAs的深度测序及相关miRNAs表达谱分析113-126
• 6.1 试验材料113-114
• 6.1.1 麦长管蚜若蚜及成蚜的收集113-114
• 6.1.2 主要数据库及软件114
• 6.1.3 主要试剂114
• 6.1.4 主要溶液配置114
• 6.1.5 主要仪器114
• 6.1.6 引物设计114
• 6.2 实验方法114-115
• 6.2.1 麦长管蚜miRNAs文库的构建、高通量测序及生物信息学分析 . 926.2.2 总RNA的提取及检测114
• 6.2.3 cDNA的合成114
• 6.2.4 RT-PCR反应体系114
• 6.2.5 qRT-PCR定量分析114-115
• 6.2.6 数据分析115
• 6.3 结果与分析115-124
• 6.3.1 麦长管蚜miRNAs高通量测序及生物信息学分析115-119
• 6.3.2 总RNA的提取及检测119-120
• 6.3.3 9 个miRNAs在两翅型不同龄期中的表达120-121
• 6.3.4 9 个miRNAs在两翅型不同龄期中的表达谱分析121-124
• 6.4 结论与讨论124-125
• 6.4.1 麦长管蚜不同龄期miRNAs的一般特征124
• 6.4.2 9 个miRNAs在两翅型不同龄期的表达谱分析124-125
• 6.5 小结125-126
• 第七章 翅型分化相关miRNAs的功能验证126-136
• 7.1 试验材料126-127
• 7.1.1 供试昆虫126-127
• 7.1.2 主要试剂和仪器127
• 7.1.3 MiRNA agomir设计与合成127
• 7.2 试验方法127-128
• 7.2.1 miR-7 agomir和miR-277 agomir的饲喂127
• 7.2.2 总RNA的提取127-128
• 7.2.3 PCR检测miRNAs在饲喂miRNA agomir后的表达128
• 7.2.4 qRT-PCR荧光定量检测miRNA agomir的过表达128
• 7.2.5 MiRNAs过表达对麦长管蚜翅型分化的影响128
• 7.2.6 数据分析128
• 7.3 结果与分析128-134
• 7.3.1 不同浓度miRNA agomir饲喂时间的死亡率128-130
• 7.3.2 总RNA提取及检测130-132
• 7.3.3 PCR检测miRNAs及内参U6在各个处理样品中的扩增132
• 7.3.4 人工饲喂miRNA agomir对相应mi RNAs表达量的影响132-134
• 7.3.5 饲喂miRNA agomir对麦长管蚜若蚜表型的影响134
• 7.4 讨论与结论134-135
• 7.5 小结135-136
• 第八章全文总结136-139
• 8.1 主要研究结果136-137
• 8.1.1 麦长管蚜两翅型不同龄期形态学的比较136
• 8.1.2 外界因子对麦长管蚜翅型分化的影响136
• 8.1.3 麦长管蚜miRNAs文库136-137
• 8.1.4 翅型分化相关的miRNAs表达谱分析及功能研究137
• 8.2 本研究的创新性137
• 8.3 下一步工作展望137-139
• 参考文献139-154
• 致谢154-156
• 作者简历156-157

【参考文献】

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