基于核磁共振的两种甲基化修饰蛋白检测

发布时间：2020-05-26 19:42

【摘要】：甲基化修饰是蛋白质翻译后修饰中的一种,在表观遗传调控中起着非常重要的作用,其机制研究受到广泛关注。核磁共振技术具有非侵入性,可提供近原位环境下蛋白质原子分辨率结构信息,在蛋白甲基化修饰研究中应用越来越广泛。然而,蛋白甲基化修饰的NMR检测往往需要同位素标记,很多蛋白的选择性标记困难,不具有普适性。这里我们采用最高量子相关谱(MAXY)在近原位环境下研究蛋白质的甲基化过程。由于MAXY谱中甲基基团最高量子态为四量子态,高于其他支链基团,可通过相干路径选择实现甲基信号的选择性检测。修饰甲基的化学位移特殊,远离其他支链甲基,使得原本二维谱检测简化成一维谱检测,大大提高了时间分辨率,有利于动态过程的实时检测;同时,支链甲基分布在分子表面,是很重要的相互作用和结构变化探针,因此该技术提供了一种简化的探针,可用于天然丰度蛋白质的构象和动力学研究。据此,我们分别以组蛋白和细胞色素c为对象展开了相关研究,主要研究内容及其结果如下:(1)组蛋白H3K4甲基化过程的实时检测:组蛋白是核小体的重要组成部分,甲基化是其最重要的翻译后修饰之一。组蛋白不仅甲基化位点多样,而且同一甲基化位点可以发生不同程度地甲基化。组蛋白不同程度、不同位点的甲基化具有不同的表观遗传调控功能。当前NMR技术可在近原位环境检测组蛋白Lys的甲基化过程,但通常需要选择性同位素标记Lys。对此,我们采用1H-13C MAXY技术,通过四量子滤波,实现了天然丰度蛋白质的组蛋白H3多肽甲基化程度及其甲基化过程的实时检测。对不同程度甲基化多肽的检测结果表明,甲基化修饰基团的化学位移通常远离常规支链甲基所处区域,处在支链CH区域,且不同程度甲基化基团的化学位移差异大。对稀溶液和细胞裂解液中组蛋白H3多肽的甲基化实时检测结果发现,该技术可消除复杂的背景信号干扰,在近生理条件(细胞裂解液)实现组蛋白的甲基化过程的实时动态观测。裂解液中H3的甲基化速率和程度均与稀溶液有很大差异,表明复杂环境影响组蛋白的甲基化。(2)基于MAXY表征细胞色素c的构象变化:细胞色素c是一个重要的多功能蛋白,它在呼吸链及细胞凋亡中均发挥着重要功能。细胞色素c的构象变化与其功能密切相关,表征细胞色素c的构象变化对于明确其发挥相关功能的分子机制至关重要。NMR是在近原位环境下表征蛋白构象的重要工具,但通常需要13C/15N等同位素标记。由于野生型细胞色素c存在翻译后修饰,故其同位素标记困难。在本文,我们尝试使用甲基化选择性检测1H-13C MAXY核磁共振技术来表征天然提纯的野生型细胞色素c的构象变化。通过1H-13C MAXY核磁共振技术得到的甲基谱图甲基信号分散性好,有效的滤掉了亚甲基、次甲基等其他信号,减少了谱峰的重叠程度,信号识别简单明了。通过突变体以及同位素标记,我们实现了对突变体细胞色素c的支链甲基归属。对突变体与野生型细胞色素c的甲基信号,我们发现两者信号几乎一致,从而指认得到了野生型细胞色素c的甲基信号。该结果表明野生型细胞色素c氧化态的构象与还原态的构象明显不同。
【图文】：

配位结合丢失，使Ｃｙｔｃ获得过氧化物酶活性。Ｃｙｔｃ氧化心磷脂（ＣＬ）的酰基链逡逑上的不饱和键，破坏膜的完整性。Ｃｙｔｃ释放至细胞质中，与凋亡蛋白酶激活因逡逑子１邋（Ａｐａｆ－１）结合形成凋亡小体，继续凋亡途径，最终导致细胞凋亡。逡逑多年以来，人们发现在酸＿或乙醇刚处理后，Ｃｙｔｃ会形成二聚结构。最近，逡逑人们已发现一个马的Ｃｙｔｃ于Ｃ端形成的二聚体的Ｘ射线晶体结构＃１。有趣的是，，逡逑二聚体的连接部位处于Ｑ－Ｉ00ｐ区，会导致Ｍｅｔ８０－ｈｅｍｅ配位结合丢失，并产生过逡逑氧化物酶活性。事实上，人们己知二聚体Ｃｙｔｃ会与线粒体膜有相互作用［４５］。与逡逑单体Ｃｙｔｃ［４６］相比，二聚体Ｃｙｔｃ也显示出过氧化物酶活性的增加。其他研宄表明，逡逑单体Ｃｙｔｃ在与膜上心磷脂（ＣＬ）相互作用时，构象变得更为舒展ｔ４７，４８］，并且与逡逑二聚体Ｃｙｔｃ的亚单位Ｘ射线晶体结构［４４］很类似。这表明二聚体Ｃｙｔｃ对于理解由逡逑Ｃｙｔｃ与ＣＬ之间的相互作用导致的过氧化物酶活性有重要作用。逡逑＊－ｓ７３逡逑

分别选取了不同程度甲基化Ｈ３多肽作为样品，对相应方法的可行性进行分析。逡逑天然丰度的邋Ｈ３（ａａｌ－２０）Ｋ４Ｍｅｌ，Ｈ３（ａａｌ－２０）邋Ｋ４Ｍｅ２，邋Ｈ３（ａａｌ－２０）邋Ｋ４Ｍｅ３邋的邋ＨＭＱＣ逡逑谱图与ＭＡＸＹ谱图如图２．１所示。由图可知，ＨＭＱＣ背景复杂，修饰甲基周围逡逑存在亚甲基，次甲基信号，与之相比，ＭＡＸＹ谱图极度简化，谱峰数量大大降逡逑低。这主要是因为采用了四量子滤波，其他亚甲基和次甲基信号均被消除造成。逡逑仅组蛋白Ｈ３（ａａｌ－２０）的Ｋ４位单、双、三甲基化信号和支链甲基得到了选择性观逡逑测。甲基化修饰基团的化学位移远离常规支链甲基，且甲基化程度不同，其化学逡逑位移也有很大差异。如三甲基修饰的化学位移的１Ｈ和１３Ｃ的化学位移分别为３．０逡逑和５３．０ｐｐｍ，双甲基化修饰基团的４和１３Ｃ的化学位移分别为２．８和４．２ｐｐｍ，而逡逑支链甲基的１Ｈ和１３Ｃ的化学位移分别＜１．５和２５．０ＰＰｍ，这主要是因为修饰基团逡逑是发生在支链Ｎ原子上，Ｎ的吸电子特性使其化学位移增大，靠近其他支链亚逡逑１６逡逑
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院武汉物理与数学研究所)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q75;O482.532

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本文编号：2682317