c-Met与结直肠癌及其肝转移的相关性及临床意义的初步探讨
【摘要】 目的：分析c-Met蛋白在结直肠癌（CRC）及CRC肝转移病人不同组织中的表达情况，并评估c-Met蛋白在不同组织中阳性表达时，发生CRC肝转移的危害值。分析在不同临床分期的CRC患者c-Met及VEGF的血清表达水平，为临床早期诊断提供临床依据。方法：采用免疫组化S-P法对c-Met蛋白在结直肠正常黏膜、CRC原发瘤、CRC转移淋巴结、CRC转移瘤的表达水平进行分析，评估c-Met蛋白在不同组织中的阳性表达水平。组间率的比较采用χ2检验，非正态分布的计量资料，组间均数比较用秩和检验；分析c-Met在结直肠正常黏膜、CRC原发瘤、CRC转移淋巴结、CRC转移瘤中的mRNA表达水平，通过对新鲜的手术标本，进行RNA水平层面的验证性试验，采用χ2检验进行计数资料组间率的比较；通过Cox模型对单因素及多因素进行统计学分析，评估c-Met蛋白的阳性表达水平与CRC发生淋巴结转移及肝转移的关系。采用Cox proportional hazardregression模型评估单因素及多因素，评价指标为危害比（HR）及95%置信区间（95%CI）；采用Elisa法对CRC的患者的c-Met及VEGF的血清水平进行评估，探讨c-Met与VEGF血清水平之间的关系。连续性变量采用独立样本t检验，相关性分析采用简单线性相关分析。结果：⑴在正常结直肠粘膜组织中，c-Met蛋白呈弱阳性表达，表达率为5.22%。在CRC原发瘤组织中，c-Met蛋白的阳性表达率为35.07%，该比例显著高于正常结直肠粘膜组织组，差异具有统计学意义（P＜0.001）。CRC阳性淋巴结中，c-Met蛋白的阳性表达率为42.33%，该比例显著高于正常结直肠粘膜组织，差异具有统计学意义（P＜0.001）；CRC肝转移灶组c-Met蛋白的阳性表达率为52.14%，该比例显著高于正常结直肠粘膜组织组，差异具有统计学意义（P＜0.001）；CRC阳性淋巴结的c-Met阳性率显著高于CRC原发瘤，差异具有统计学意义（42.33%vs35.07%，P=0.000）。CRC肝转移灶的c-Met阳性率显著高于CRC原发瘤，差异具有统计学意义（52.14%vs35.07%，P=0.000）；CRC肝转移灶的c-Met阳性率显著高于CRC阳性淋巴结，差异具有统计学意义（52.14%vs42.33%，P=0.041）。c-Met蛋白（+）组高、中、低分化程度的比例分别为22.36%、23.62%、54.02%，c-Met蛋白（-）组则分别为69.34%、25.37%、5.29%，组间差异具有显著统计学意义（P＜0.05）；c-Met蛋白（+）组T1-4的比例分别为7.79%、11.06%、50.57%、30.58%，c-Met蛋白（-）组则分别为32.29%、33.65%、30.66%、3.39%，组间差异具有显著统计学意义（P＜0.05）；c-Met蛋白（+）组淋巴结未转移与淋巴结转移者的比例分别为24.87%、75.13%，c-Met蛋白（-）组则分别为34.06%、65.94%，c-Met蛋白（+）组淋巴结转移的比例显著高于c-Met蛋白（-）组（75.13%vs65.94%，P＜0.05）；c-Met蛋白（+）组无远处转移和远处转移者的比例分别为86.93%、13.07%，c-Met（-）组则分别为97.96%、2.04%，c-Met蛋白（+）组远处转移的比例显著高于c-Met蛋白（-）组（13.07%vs2.04%，P＜0.05）；c-Met蛋白（+）组肿瘤直径（≤2、2-5、≥5cm）的比例分别为31.16%、32.91%、35.93%，c-Met蛋白（-）组则分别为30.39%、34.06%、35.55%，组间差异无统计学意义（P＞0.05）。⑵以正常结直肠粘膜组织作为对照， c-Met mRNA相对含量为（0.572±0.051），当所测mRNA值/-actin值＞0.61时，为阳性表达。结直肠腺瘤组织（0.781±0.064），其c-Met mRNA含量与正常结直肠粘膜组织相似，差异无统计学意义（P＞0.05）。CRC、CRC阳性淋巴结、CRC肝转移灶中c-MetmRNA含量分别为（1.138±0.174）（pg/ml）、（1.486±0.184）（pg/ml）、（1.372±0.168）（pg/ml），均显著高于正常结直肠粘膜组，差异具有统计学意义（all P＜0.05）。CRC阳性淋巴结、CRC肝转移灶中c-Met mRNA含量显著高于CRC组织，差异具有统计学意义（all P＜0.05）。CRC阳性淋巴结与CRC肝转移灶中c-Met mRNA含量相似，差异无统计学意义（P=0.681）。⑶单因素分析纳入了16个因素，其中危险因素为：性别（HR:1.222;95%CI:1.021-1.468，P=0.0482），年龄（HR:1.645;95%CI:1.315-2.062，P＜0.0001），家族史（HR:2.313;95%CI:1.811-7.651，P=0.0004），分化程度（P＜0.0001），体重减轻（HR:1.697;95%CI:1.320-2.092，P＜0.0001），T分期（P＜0.0001），N分期（P＜0.0001），CRC原发瘤c-Met表达（HR:5.558;95%CI:7.829-13.24，P＜0.0001），淋巴结c-Met的阳性表达（HR:4.982;95%CI:5.267-8.554，P＜0.0001），肝转移灶c-Met表达（HR:4.324;95%CI:3.753-5.957，P＜0.0001），糖尿病（HR:1.503;95%CI:1.222-2.072，P=0.0007）；预防因素分别为：术前放疗（HR:0.5749;95%CI:0.4882-0.8029，P=0.0003），术前放化疗（HR:0.2122;95%CI:0.3068-0.4833，P＜0.0001）。无统计学差异的是吸烟（HR:1.036;95%CI:0.8275-1.301，P=0.7525），饮酒（HR:0.970;95%CI:0.7740-1.214，P=0.7892），术前低蛋白（HR:1.169;95%CI:0.9256-1.504，P=0.1888）。多因素分析认为：T分期是CRC发生肝转移较弱的危险因素（HR:1.161;95%CI:1.017-1.325，P=0.027）；其他作用较强的危险因素包括：分化程度（HR:3.601;95%CI:2.521-5.694，P=3.601）、N分期（HR:4.210;95%CI:3.45-5.137，P=4.210）、CRC原发瘤c-Met蛋白阳性表达（HR:1.678;95%CI:1.160-2.429，P=1.678）、CRC转移淋巴结c-Met蛋白的阳性表达（HR:1.728;95%CI:1.437-3.212，P=1.728）、肝转移灶c-Met蛋白的阳性表达（HR:2.964;95%CI:1.796-4.890，P=2.964）。其中N分期（HR:4.210）是影响CRC发生肝转移最强的危险因素；术前放化疗（HR:0.841;95%CI:0.417-0.934，P=0.841）则是CRC发生肝转移的预防因素。⑷健康人群及CRC患者c-Met血清水平分别为（98.15±10.72）、（271.42±68.64），VEGF血清水平分别为（197.97±38.47）、（486.17±55.21）。CRC患者的c-Met、VEGF血清平均水平分别是健康人群的2.77倍和2.46倍，差异均具有统计学意义（all P＜0.05）。CRC患者的c-Met与VEGF血清水平呈正相关（r=0.9655，P＜0.0001）。按临床分期划分，I-IV的CRC患者c-Met血清水平分别为（155.97±40.59）、（216.35±16.36）、（301.72±14.54）、（356.61±14.98）。I-IV的CRC患者VEGF血清水平分别为（220.29±17.76）、（328.11±14.54）、（442.33±16.13）、（526.30±17.37）。I期CRC患者c-Met与VEGF并不呈相关性（r=-0.09675，P=0.7215），II、III、IV期CRC患者c-Met与VEGF均呈现正相关（all P＜0.05）。结论：（1）c-Met在CRC的疾病演变过程中扮演着重要角色，c-Met蛋白的表达水平可能与CRC疾病进展密切相关，当c-Met高表达时，可能预示着CRC的进展程度及恶性程度。（2）c-Met蛋白、 c-Met mRNA表达及c-Met血清水平升高具有同步性，当发生CRC肝转移时，阳性转移淋巴结、肝转移灶c-Met mRNA的表达也显著增加。（3）对c-Met蛋白在CRC原发瘤、CRC转移淋巴结的表达水平进行检测，有利于提高对CRC病人术后复发，转移风险的预判。若c-Met蛋白阳性表达，其发生肝转移的风险分别是c-Met蛋白阴性表达的1.678倍、1.728倍。（4）CRC患者的c-Met、VEGF血清水平分别是健康人群血清的2.77倍和2.46倍，CRC患者c-Met与VEGF血清水平呈正相关。对CRC患者进行c-Met的血清检测，可能可以作为CRC患者诊断和术后监控的手段之一。
临床
尽管 CRC 的诊断和治疗已有很大的进步，但其 5 年生存率仍徘徊在40%-60%，总体预后仍不能令人满意。CRC 患者肝转移的发生率较高，约达到50% [4]，且肝转移常常是 CRC 治疗失败的常见原因之一 [4, 5]。尽管各种治疗手段较多 [6]，但目前最佳的治疗方法仍然是外科手术 [7]。然而，根据近期的一些大宗病例统计报告，CRC 肝转移患者的手术切除率仅仅为 20-30% [8,9]，大部分的原因主要与患者的病期较晚、一般情况较差有关。CRC 肝转移的患者如发现较早、一般情况较好，仍可行外科的根治性切除，约 1/3 的 CRC肝转移患者根治性切除后的生存时间仍可以达到 5 年 [7-9]。但无手术治疗机会患者的预后较差，生存时间一般难以超过 12 个月 [10, 11]。因此，针对 CRC患者的早诊、早治、和预防复发/转移等越来越受到关注，已成为 CRC 治疗的热点问题之一。许多学者认为，若能通过早期诊断 CRC 患者发生了肝转移，并及早对高危群体给予预防性的措施，这有希望改善 CRC 肝转移治疗的临床总体治疗效果。
目前，针对 CRC 患者肝转移的诊断主要是通过血清 CEA 水平的检测及相关影像学检查（B 超、CT、MRI 或 PET-CT）等方法来完成，然而 CEA 水平的升高缺乏针对 CRC 肝转移诊断的特异性；而影像学的检查对于微小病灶的诊断灵敏度往往较低，当影像学发现肿瘤的病灶时，往往提示了肿瘤的病情已进展到一定的阶段；因此，当前的常规手段其敏感性和时效性均有待进一步提高，特别是对 CRC 患者肝转移发生的几率和风险性的预测，可能会导致临床过程中要么盲目或过度的治疗、要么可能导致诊断和治疗的迟延。从而导致了部分 CRC 肝转移的患者错过了最佳的手术时机。故及时预测和早期诊断肝转移成为了目前 CRC 治疗的关键点。
现阶段认为：恶性肿瘤的发生、发展是一个多基因、多阶段、多因素、多个生物调控通道参与的复杂过程。根据肿瘤的生物学特性，肿瘤组织中的癌细胞存在不均一性和异质性。即原发肿瘤中存在着各种不同的亚组肿瘤细胞，它们的侵袭、转移能力是不同的。某些高侵袭、高转移表型的恶性肿瘤细胞，它们主要是受到相关的基因所决定和调控的。这些相关的基因发生异常改变后，它们对肿瘤细胞的恶性程度、增殖、粘附、侵袭、迁移及转移等各种过程起到了至关重要的作用。故就理论而言，高侵袭与低侵袭性癌细胞的基因表达谱应该是不同的。
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第一章 c-Met 蛋白在结直肠癌不同组织中的表达水平
一、材料与方法
1 材料
1.1 纳入病例
所有组织标本取自广西医科大学附属肿瘤医院、贵港市人民医院 2007 年1 月至 2011 年 6 月期间胃肠外科经手术治疗的 1135 例 CRC 患者，其中男性675 例，女性 460 例，年龄 16-80 岁，中位年龄 60 岁。根据病理类型分为：管状腺癌 649 例，乳头状腺癌 342 例，粘液腺癌 144 例。按肿瘤的分化程度分为：高分化腺癌 154 例，中分化腺癌 381 例，低分化腺癌 600 例；按国际抗癌联盟( UICC)1997 年修订的 PTNM 分期标准分为：I 期 169 例，II 期 392 例（I+II 期 551 例），III 期 457 例，IV 期 117 例（III+IV 期 574 例）。同时，选择相同时间段内结直肠正常黏膜切片 134 例作为正常对照组，其中男性 83 例，女性 51 例，年龄在 40-75 岁之间，中位年龄为 56 岁。所选择的 CRC 病例均经外科手术治疗，并经过术后病理证实。所有 IV 期的 CRC 患者均选取伴随淋巴结转移的病例，若不伴随淋巴结转移者予以剔除。所有 CRC 病例均无其他严重内科疾病或伴发其他恶性肿瘤，所有 CRC 远处转移患者均选取肝转移患者，若合并其他部位转移者予以剔除。
2 方法
2.1 实验仪器
（1）电热安全压力锅：广东美的生活电器制造有限公司，型号为 MY-CS60；
（2）转轮石蜡切片机：德国 LEICA 公司， 型号为 RM2235；
（3）高压灭菌消毒锅：日本 TOMY， 型号为 SS-325；
（4）烤箱：上海跃进， 型号为 101-2-BS；
（5）病理图象分析仪器：日本 OLYMPUS 公司， 型号 DP-BSW；
（6）光学显微镜：重庆市光学仪器厂；
（7）病理图像分析软件：美国 Media Cybernetics 公司，软件版本 Image-Pro Plus6.0；
（8）全自动照相装置：日本 OLYMPUS 公司，型号 BX60F5 PM20-35
（9）微量移液器（10μl、20μl、200μl、500μl）：北京青云公司；
（10）奥林巴斯双目显微镜：日本 OLYMPUS 公司， 型号 CX41；
（11）PHY-Ⅲ型病理组织漂烘处理仪：常州中威电子仪器厂；
（12）多聚赖氨酸防脱载玻片：上海市太阳生物技术有限公司，型号 T-005-1；（13）4℃冰箱：容声冰箱厂；
（14）微波炉：格兰仕集团,广东顺德制造；
（15）ID-Ⅲ型快速生物医学实验仪湿盒：日本松下电器公司；
（16）PHS-25 型酸度计：上海市雷磁仪器厂；
（17）实验用 Tip 头用 0.1%DEPC 处理过的水浸泡后，均进行 120℃高压 30分钟灭菌，烘干备用。
（18）耐高温的实验冲洗瓶、孵育盒、医用塑料片架均购自福州迈新公司。
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二、结果
正常结直肠构造粘膜上皮呈单层柱状，由柱状细胞核杯状细胞构成，细胞巨细均一、分列划一，固有层内含有大量由上皮下陷而成的结直肠腺瘤，呈单管状，布局划一完备；结直肠高分解腺癌：低倍镜见细胞多分列成巨细纷歧，形态不等的腺管状，有的呈乳头状，有的扩张呈小囊腔状。高倍镜可见癌细胞呈高柱状，巨细纷歧，分列混乱，多为复层，失去极性，核巨细纷歧，浓染。癌细胞分列呈大的管腔样，不规整，腔内可见有坏去世脱落的癌细胞；结直肠低分解腺癌：癌构造无完备腺腔样布局，癌细胞分列呈条索状或片状，癌细胞小，异型性显着，核破裂较多；CRC 中分解腺癌：癌构造多数（>50%）呈腺管样分列，管腔形状不规矩、巨细纷歧，少部门癌构造可呈实性条索状或巢状分列，细胞核分列乱七八糟。
c-Met 蛋白的阳性表达主要表现为细胞膜上出现棕黄色弥漫性染色或棕黄色颗粒，细胞核未见着色。按照肿瘤细胞浆及细胞膜染色评分标准分别进行评分。如图 A-D 所示：图 A1-2 为正常结直肠粘膜；图 B1-2 为 CRC 组织；图 C1-2为 CRC 转移淋巴结；图 D1-2 为 CRC 肝转移灶。
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第二章 结直肠癌组织 c-Met mRNA 的表达水平.................... 57-83
一、 材料与方法............................ 57-72
二、 结果....................... 72-75
三、 讨论 ...................75-79
四、 结论.................... 79-80
五、 参考文献 ..........................80-83
第三章 c-Met 蛋白表达与结直肠癌肝转移关系的多因素分析 .......................................83-113
一、 材料与方法 ....................83-94
二、 结果 ....................94-106
三、 讨论........................................... 106-109
四、 结论 .................................109-110
五、 参考文献 ...............................110-113
第四章 c-Met 与 VEGF 的血清的检测分析
一、材料与方法
1 实验的材料及选择
1.1 纳入病例
所纳入 CRC 患者及对照组均来自广西医科大学附属肿瘤医院。选择时间段为 2011 年 6 月-2012 年 6 月。CRC 患者来自广西医科大学附属肿瘤医院胃肠外科，诊断为 CRC 的住院患者 115 例，其中男性 83 例，女性 32 例，年龄29-71 岁，中位年龄 54 岁。按分化程度分为：低分化腺癌 84 例，中分化腺癌22 例，高分化腺癌 9 例。根据临床分期：I 期 6 例，II 期 37 例（I+II 期 43 例），III 期 51 例，IV 期 21 例（III+IV 期 72 例）。选择同期在广西医科大学附属肿瘤医院门诊健康体检者作为对照组（共计 108 例）。其中男性 67 例，女性 41例，年龄 30-70 岁，中位年龄 49 岁。所有纳入人员均无糖尿病、心脏病、高血压等其他疾病，血清学检测 HIV、HCV 等均为阴性。采血前 CRC 患者未经任何治疗，所有 CRC 患者均为病理证实，所有 CRC 远处转移患者均选取肝转移患者，若合并其他部位转移者予以剔除。体检者未采取任何干预。所有纳入人员均签订知情同意书。
1.2 血清的采样
所有 CRC 患者和对照健康人群均为晨起空腹时取血，每例均采取 10ml的外周静脉血，静置于 10℃以下，待 500rpm 离心 15 分钟后，上清分装到冻存的试管中，-70℃保存，备用。
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总结
c-Met 蛋白的异常高表达伴随着 CRC 疾病进展的各个阶段，c-Met 蛋白在CRC 的发生发展和转移侵袭中可能起着重要作用。当 c-Met 蛋白高表达时，笔耕文化传播，可能预示着CRC的进展程度及恶性程度，也可能是CRC肝转移的危险因素之一。检测 c-Met 蛋白的表达水平有可能为评价 CRC 的生物学行为趋势提供较有价值的参考依据。
对于外科的初治病人，鉴于行 CRC 根治手术时可能已存在微转移的可能，及时针对 CRC 原发瘤及淋巴结进行 c-Met 蛋白表达的检测和评估，若 c-Met蛋白阳性表达，其发生肝转移的风险分别是 c-Met 蛋白阴性表达的 1.678 倍、1.728 倍。分选出术后复发及肝转移的高危人群，并对其进行密切随访，根据具体情况，尽早对其进行相应的干预治疗，可能是当前 CRC 术后预防复发、转移的有效补充。
c-Met 蛋白、c-Met mRNA 表达水平升高具有同步性，当发生 CRC 肝转移时，阳性转移淋巴结、肝转移灶 c-Met mRNA 的表达也显著增加。CRC 患者血清c-Met、VEGF水平随着临床分期增高而逐渐增高。CRC患者c-Met与VEGF血清水平呈正相关。对 CRC 患者进行 c-Met 的血清检测，可能可以作为 CRC患者诊断和术后监控的手段之一。
然而，由于实验时间较短，实验室设备、条件，资金等多方面因素的限制，本次实验设计仅限于 CRC 临床样本的 c-Met 的检测，未能从相关机制上完全阐明 HGF/c-Met 信号通路的作用机制，难以根本上求证 c-Met 与 CRC 恶性程度和转移相关的可能机制，这对于本文中的结论说服力有一定限制。但由于检测样本量较大，统计学处理得当，结果可靠。
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[1] 吴子刚,贾文婷,陈东燕,杨丽莉,何敏,邹兵,王俊懿,高锦. c-met基因表达与大肠腺瘤演化与癌变过程相关性的研究[J]. 中华肿瘤防治杂志. 2008(23)
[2] 魏松锋,高明,于洋,李小龙,高松源,钱碧云. HGF、CXCR-4、VEGF-D表达与甲状腺乳头状癌颈淋巴结转移的关系[J]. 现代肿瘤医学. 2008(08)
[3] Deng-Fu Yao, Xin-Hua Wu, Yong Zhu, Gong-Sheng Shi, Zhi-Zhen Dong, Deng-Bing Yao, Wei Wu, Li-Wei Qiu and Xian-Yong Meng Nantong, China Research Center of Clinical Molecular Biology , Department of Pathology and Department of Gastroenterology , Affiliated Hos- pital of Nantong University; Department of Diagnostics , and Institute of Neurosciences , Nantong University; Nantong 226001, China. Quantitative analysis of vascular endothelial growth factor, microvascular density and their clinicopathologic features in human hepatocellular carcinoma[J]. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 2005(02)
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本文编号：10878
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