脊柱结核患者椎间盘MMPs和ADAMTS-4基因表达以及与其临床资料的关联研究

发布时间：2015-01-09 12:34

 

【摘要】 1背景与目的我国脊柱结核发病率占全身骨、关节结核病发病率的首位。家庭经济贫困、自身营养不良、HIV病毒感染以及结核菌耐药性等多种因素加速了脊柱结核的传播。脊柱结核容易导致患者发生脊柱后凸畸形和下肢截瘫等严重并发症。在脊柱结核发病早期，感染常发生于椎体前部，但伴随疾病的发展，感染往往向前纵韧带方向播散，最终导致邻近多个椎体都发生结核破坏。当相邻椎体均受到结核破坏时，椎间盘也将受到破坏，发生变性坏死。虽然椎间盘发生破坏是脊柱结核疾病的一个重要疾病特征，但是关于结核菌破坏椎间盘的发生机制却鲜少报道。近期研究发现基质金属蛋白酶(matrix metal—loproteinases，MMPs)和含I型血小板结合蛋白基序(TSP)的解聚蛋白样金属蛋白酶(a disintegrin like and metal loproteinasewith thrombospondin type1motifs，ADAMTS)在细胞外基质破坏中发挥重要作用。MMPs是一类含有Zn2+的蛋白酶家族，由于其具有分解细胞外基质成分的功能，在人体生理性组织重构和免疫调节中发挥重要作用。含I型血小板结合蛋白基序(TSP)的解聚蛋白样金属蛋白酶(a disintegrinlike and metal loproteinase with thrombospondin type1motifs，ADAMTS)是一类Zn2+依赖的分泌型金属蛋白酶，而其中的ADAMTS-4是一种软骨基质聚集蛋白聚糖（aggrecan）的降解酶。ADAMTS-4对于关节软骨中含有的大量aggrecan具有降解作用，导致关节软骨的抗压力和张力等物理属性下降。由于在脊柱结核患者椎间盘的破坏过程中，椎间盘软骨基质也发生破坏，根据理论推测ADAMTS-4参与了脊柱结核椎间盘的破坏。本研究分析ADAMTS-4，MMP-3, MMP-8, MMP-9, MMP-13, MMP-14基因在结核性椎间盘组织、退行性椎间盘组织和正常椎间盘组织内的表达情况以及差异性，通过Spearman秩相关分析MMPs表达的配对相关性，研究阐明脊柱结核患者椎间盘损害的发生机制，为治疗脊柱结核提供一定的理论依据。本次研究还通过详细调查各个脊柱结核患者的临床资料，结合MMPs和ADAMTS-4基因表达数据，分析研究各项基因表达指标与脊柱结核临床资料之间的相关性，为综合全面的治疗脊柱结核疾病提供理论基础。2方法2.1脊柱结核组（TB group）：60例结核椎间盘组织标本取自广西医科大学第一附属医院2011年3月1日至2012年4月30日在脊柱骨病外科接受手术治疗的脊柱结核患者。椎间盘突出组（ID group）：60例退行性椎间盘组织标本取自广西医科大学第一附属医院2011年3月1日至2012年4月30日在脊柱骨病外科接受手术治疗的椎间盘突出患者。正常组（controlgroup）：60例正常椎间盘组织标本取自广西医科大学第一附属医院2011年3月1日至2012年4月30日在脊柱骨病外科接受手术治疗的外伤性脊柱骨折患者。实验样本获得以后，由两名经验丰富的病理学家对组织标本进行检查，确保样本的准确性。所有样本由外科手术获得后，立即放入-80℃液氮中冷冻并保存直至进行组织RNA提取。2.2采用组织RNA提取技术和实时荧光定量PCR（Real time fluorescentquantitative PCR,RT-PCR）技术，研究分析ADAMTS-4， MMP-3,-8,-9,-13,-14的mRNA转录水平在结核性椎间盘组织、退行性椎间盘组织和正常椎间盘组织内的表达情况以及差异性。通过Spearman秩相关分析MMPs表达的配对相关性。2.3采用临床问卷调查与实验室检查相结合的方式进行相关资料的采集。本次研究选取三组人员的临床资料包括：年龄，性别，职业，吸烟习惯，疼痛强度（视觉模拟量表评分，VAS），患病的脊柱节段，症状持续时间，C-反应蛋白（CRP）和血沉水平（ESR）。结合MMPs和ADAMTS-4基因表达数据，分析研究各项基因表达指标与脊柱结核临床资料之间的相关性。3结果3.1RT-PCR结果显示，脊柱结核组和椎间盘突出组的ADAMTS-4表达显著增高，与正常组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。脊柱结核组的ADAMTS-4表达虽然比椎间盘突出组高，但差异无统计学意义。脊柱结核组和椎间盘突出组的MMP-3表达增高，与正常组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。脊柱结核组的MMP-3表达虽然比椎间盘突出组高，但差异也无统计学意义。脊柱结核组的MMP-8表达显著增高，与正常组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。脊柱结核组的MMP-8表达比椎间盘突出组高，差异有统计学意义(P<0.05)。脊柱结核组的MMP-9表达显著增高，与正常组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。脊柱结核组的MMP-9表达比椎间盘突出组高，差异有统计学意义(P<0.05)。脊柱结核组和椎间盘突出组的MMP-13表达显著增高，与正常组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。脊柱结核组的MMP-13表达比椎间盘突出组高，差异有统计学意义(P<0.05)。脊柱结核组和椎间盘突出组的MMP-14表达显著增高，与正常组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。脊柱结核组的MMP-14表达比椎间盘突出组高，但差异无统计学意义。3.2研究数据表明，疾病越严重的脊柱结核患者的MMPs表达水平越高。中重度脊柱结核患者的MMP-3，-8，-9，-14表达水平显著增大(P<0.05)。轻中重度脊柱结核患者的MMP-13的表达水平均显著增大(P<0.05)。3.3脊柱结核组和椎间盘突出组的MMPs表达具有多重正相关性。具体而言，脊柱结核组的MMP-13表达水平与MMP-8，-9有显著的正相关性。此外脊柱结核组的MMP-8，-9表达水平之间也存在显著的正相关性。3.4脊柱结核组和椎间盘突出组：ADAMTS-4基因表达与患者的年龄、性别、职业、吸烟习惯、疼痛强度、患病的脊柱节段、症状持续时间、C-反应蛋白和血沉水平均无相关性(P＞0.05)。脊柱结核组： MMP-3基因表达与吸烟习惯有正相关性(P=0.007)。MMP-3基因表达与患者的年龄、性别、职业、疼痛强度、患病的脊柱节段、症状持续时间、C-反应蛋白和血沉水平均无相关性(P＞0.05)。脊柱结核组： MMP-8基因表达与年龄(P=0.011)、疼痛强度(P=0.014)、C-反应蛋白(P=0.004)和血沉水平(P=0.002)有正相关性。MMP-8基因表达与患者的性别、职业、患病的脊柱节段、症状持续时间等无相关性(P＞0.05)。椎间盘突出组：MMP-8基因表达与年龄(P=0.032)、C-反应蛋白(P=0.003)和血沉水平(P=0.005)有正相关性。MMP-8基因表达与患者的性别、职业、吸烟习惯、疼痛强度、患病的脊柱节段、症状持续时间等无相关性(P＞0.05)。剧烈疼痛患者（VAS8-10）的MMP-8表达水平比轻度疼痛患者（VAS0-4）显著增大(P<0.05)。高CRP患者（>30mg/L）的MMP-8表达水平比低CRP患者（<10mg/L）显著增大(P<0.05)。高ESR患者（>40mm/h）的MMP-8表达水平比低ESR患者（<20mm/h）显著增大(P<0.05)。脊柱结核组：MMP-9基因表达与疼痛强度(P=0.026)、症状持续时间(P=0.021)、C-反应蛋白(P=0.006)和血沉水平(P=0.013)有正相关性。MMP-9基因表达与患者的年龄、性别、职业、患病的脊柱节段等无相关性(P＞0.05)。剧烈疼痛患者（VAS8-10）的MMP-9表达水平比轻度疼痛患者（VAS0-4）显著增大(P<0.05)。3–12months症状持续时间患者的MMP-9表达水平比<3months症状持续时间患者显著增大(P<0.05)。高CRP患者（>30mg/L）的MMP-9表达水平比低CRP患者（<10mg/L）显著增大(P<0.05)。脊柱结核组：MMP-13基因表达与吸烟习惯(P=0.019)、疼痛强度(P=0.016)、症状持续时间(P=0.012)、C-反应蛋白(P=0.002)和血沉水平(P=0.009)有正相关性。MMP-9基因表达与患者的年龄、性别、职业、患病的脊柱节段等均无相关性(P＞0.05)。剧烈疼痛患者（VAS8-10）的MMP-13表达水平比轻度疼痛患者（VAS0-4）显著增大(P<0.05)。3–12months症状持续时间患者的MMP-13表达水平比<3months症状持续时间患者显著增大(P<0.05)。高ESR患者（>40mm/h）的MMP-13表达水平比低ESR患者（<20mm/h）显著增大(P<0.05)。脊柱结核组和椎间盘突出组：MMP-14基因表达与患者的年龄、吸烟习惯、性别、职业、疼痛强度、患病的脊柱节段、症状持续时间、C-反应蛋白和血沉水平均无相关性(P＞0.05)。4结论4.1本研究证实椎间盘组织中ADAMTS-4的表达情况与椎间盘结核性破坏有关，推测ADAMTS-4在脊柱结核椎间盘破坏的发病机制中发挥了重要的作用。研究证实退变性腰椎间盘组织的ADAMTS-4表达显著增高，ADAMTS-4在椎间盘突出症的发病机制中发挥了重要的作用。4.2本研究证实椎间盘组织中MMP-3，-8,-9,-13,-14的表达情况与椎间盘结核性破坏有关，推测MMP-3，-8,-9,-13,-14在脊柱结核椎间盘破坏的发病机制中发挥了重要的作用。研究证实退变性腰椎间盘组织的MMP-3，-13,-14表达显著增高，MMP-3，-13,-14在椎间盘突出症的发病机制中发挥了重要的作用。4.3本次研究证实MMP-8，-9，-13在椎间盘结核性破坏的过程中发挥了协同作用。研究证实MMP-3，-8，-9，-14表达水平与椎间盘结核性破坏的严重程度具有相关性。4.4本研究证实结核性椎间盘组织中MMP-3，-13的表达情况与吸烟习惯有正相关性，推测吸烟是影响脊柱结核预后的不利因素。本研究证实结核性椎间盘组织中MMP-8,-9，-13的表达情况与疼痛强度有正相关性，推测疼痛可能通过增加炎性反应的途径，加重脊柱结核病的病情。本研究证实结核性椎间盘组织中MMP-9，-13的表达情况与症状持续时间有相关性，推测症状持续时间长短是影响脊柱结核预后的相关因素。本研究证实结核性椎间盘组织中MMP-8,-9，-13的表达情况与CRP有正相关性，推测高水平的CRP是影响脊柱结核预后的不利因素。本研究证实结核性椎间盘组织中MMP-8,-9，-13的表达情况与ESR有正相关性，推测高水平的ESR是影响脊柱结核预后的不利因素。 

前 言

在当今全球范围内结核病仍是一个最具威胁性的感染性疾病。我国是世界全球22个结核病高负担国家中的重灾国，结核病感染人数约占全球结核病患者人数的第二位。据统计我国约有4亿多结核杆菌感染者，而且每年约有145万新发结核病患者，其中65万患者属于中高传染性患者。我国传染病死亡患者中，约有13万人死于结核病，居各类传染病首位[1-3]。此外，在我国结核病患者中，28%的患者属于耐药菌感染者，而且许多都是耐多药结核杆菌感染。骨关节结核在肺外结核中发病率最高，而其中50%属于脊柱结核，随着世界结核病流行的加剧，脊柱结核的发病率也不断的增高，严重的影响了我国人民的生命健康[4,5]。
脊柱结核属于肺外结核，是由于脊柱感染结核杆菌后，造成椎体骨质和椎间盘破坏并且伴发结核性脓肿形成[6]，约占骨关节结核发病率的50%-75%。单核细胞浸润和组织坏死性改变是脊柱结核主要病理学改变。脊柱结核性炎症早期以渗出性病变为主，此阶段患者机体免疫力低下，结核菌量多，毒素强，主要表现为浆液纤维素性炎症。在脊柱结核发病后期主要以增生性病变为主，此阶段患者机体免疫力增强，结核菌量少，主要表现为特征性结核结节形成[7]。在菌量多、毒素强、抵抗力低、变态反应强等因素共同作用下，无论是早期脊柱结核还是后期脊柱结核均可发生干酪样坏死[8]。家庭经济贫困、自身营养不良、HIV 病毒感染以及结核菌耐药性等多种因素加速了脊柱结核的传播。在脊柱结核发病早期，感染常发生于椎体前部，但伴随疾病的发展，结核性感染往往向前纵韧带方向播散，最终导致邻近多个椎体都发生结核破坏[9，10]。当相邻椎体均受到结核破坏时，椎间盘也将受到破坏，发生变性坏死。在脊柱结核发病的过程中，不断破坏的椎体再也不能承受身体重量，继而发生塌陷变形，导致患者发生脊柱后凸畸形[10-13]。当破坏的椎间盘以及其他组织发生液化后，可以形成结核性脓肿，向后压迫脊髓，导致患者神经系统出现物理性和化学性损伤，发生下肢瘫痪等严重并发症[11]。
椎间盘破坏是脊柱结核的一个特征性改变。结核菌导致的椎间盘破坏、塌陷，对脊髓容易形成压迫，发生瘫痪等严重并发症，因此脊柱结核导致的并发症和致残率远远大于其他的骨关节结核和肺外结核[12,13]。此外由于耐多药结核菌株的不断增多，治疗脊柱结核的难度愈发困难。因此研究结核杆菌引起椎间盘破坏的发病机制，对脊柱结核防治意义重大。椎间盘发挥的生物学功能是：在两个相邻椎体之间维持正常的椎间隙高度，有效对抗剪切力和压缩力，使两相邻椎体可以进行相对活动，并且维持在一个无痛范围内。椎间盘组织结构中的蛋白多糖可以通过吸引水和Mg2+、K+、Ca2+、Na+等正离子，保持调节椎间盘组织中的水分和阳离子分布，对椎间盘组织结构的稳定，发挥重要的作用。此外蛋白多糖还可以结合胶原或弹性蛋白，形成更为稳固的生物结构，发挥润滑、粘合及缓冲外界压力等结缔组织的作用。椎间盘负载下的静水压、蛋白多糖形成的渗透压、一定大小的有效孔径等三方面作用，共同控制了椎间盘的水分进出，使之达到平衡[14,15]。因此，蛋白多糖的水解情况决定了椎间盘组织水分的保持能力。核心蛋白是人体蛋白多糖的主要功能区，核心蛋白的一个重要降解酶是基质金属蛋白酶(matrix metal-loproteinases，MMPs)。
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第一部分 ADAMTS-4 基因在脊柱结核患者椎间盘组织中的表达研究

1 引 言
中国是一个结核病高负担国家，据统计中国人群结核菌感染率约占44.5% ,每年就有 13 万人左右因结核病死亡[1，2]。在这其中有 13%的结核病是骨关节结核，而脊柱结核发病率约占骨关节结核发病率的 50%-75%。脊柱结核属于肺外结核，是由于脊柱感染结核杆菌后，造成椎体骨质和椎间盘破坏并且伴发结核性脓肿形成[3,4]。单核细胞浸润和组织坏死性改变是脊柱结核主要病理学改变。脊柱结核性炎症早期以渗出性病变为主，此阶段患者机体免疫力低下，结核菌量多，毒素强，主要表现为浆液纤维素性炎症。在脊柱结核发病后期主要以增生性病变为主，此阶段患者机体免疫力增强，结核菌量少，主要表现为特征性结核结节形成[5]。在菌量多、毒素强、抵抗力低、变态反应强等因素共同作用下，无论是早期脊柱结核还是后期脊柱结核均可发生干酪样坏死[6]。
中国是一个结核病高负担国家，据统计中国人群结核菌感染率约占44.5% ,每年就有 13 万人左右因结核病死亡[1，2]。在这其中有 13%的结核病是骨关节结核，而脊柱结核发病率约占骨关节结核发病率的 50%-75%。脊柱结核属于肺外结核，是由于脊柱感染结核杆菌后，造成椎体骨质和椎间盘破坏并且伴发结核性脓肿形成[3,4]。单核细胞浸润和组织坏死性改变是脊柱结核主要病理学改变。脊柱结核性炎症早期以渗出性病变为主，此阶段患者机体免疫力低下，结核菌量多，毒素强，主要表现为浆液纤维素性炎症。在脊柱结核发病后期主要以增生性病变为主，笔耕文化传播，此阶段患者机体免疫力增强，结核菌量少，主要表现为特征性结核结节形成[5]。在菌量多、毒素强、抵抗力低、变态反应强等因素共同作用下，无论是早期脊柱结核还是后期脊柱结核均可发生干酪样坏死[6]。
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2 材料和方法
2.1 标本来源
本研究经广西医科大学伦理委员会批准,所获得的标本均履行告知义务并签署知情同意书。实验过程按照 1964 年赫尔辛基宣言及其后的修正案中列出的道德标准进行。
脊柱结核组（TB group）：60 例结核椎间盘组织标本取自广西医科大学第一附属医院 2011 年 3 月 1 日至 2012 年 4 月 30 日在脊柱骨病外科接受手术治疗的脊柱结核患者。脊柱结核组患者纳入标准：具有中度发热，肢体乏力，腰痛和下肢肌力减退等脊柱结核的典型症状；患者血液检查，结核菌素皮肤试验，组织病理学检查和影像学检查，如 X 线摄影，计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）均支持脊柱结核疾病诊断；同时具有获得性免疫缺陷综合征（AIDS），肿瘤和强直性脊柱炎的患者被排除在外。
椎间盘突出组（ID group）：60 例退行性椎间盘组织标本取自广西医科大学第一附属医院 2011 年 3 月 1 日至 2012 年 4 月 30 日在脊柱骨病外科接受手术治疗的椎间盘突出患者。椎间盘突出组患者临床症状以及影像学检查均符合椎间盘突出症诊断标准。
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第二部分 MMP-3, -8, -9, -13,-14 基因在脊柱结核患者椎间盘组织中的表达研究 ....53-102 
1 引言 ........................53-56 
2 材料与方法......................... 56-63 
3 结果............ 63-87 
4 讨论................. 87-94 
5 结论 ........................94-95 
6 参考文献 ...................95-102

第三部分 MMPs 和 ADAMTS-4 基因表达与脊柱结核患者临床资料的相关性分析

1 引 言
在当今全球范围内结核病仍是一个最具威胁性的感染性疾病。我国是世界全球22个结核病高负担国家中的重灾国，结核病感染人数约占全球结核病患者人数的第二位。据统计我国约有4亿多结核杆菌感染者，而且每年约有145万新发结核病患者，其中65万患者属于中高传染性患者。我国传染病死亡患者中，约有13万人死于结核病，居各类传染病首位[1-3]。此外，在我国结核病患者中，28%的患者属于耐药菌感染者，而且许多都是耐多药结核杆菌感染。骨关节结核在肺外结核中发病率最高，而其中50%属于脊柱结核，随着世界结核病流行的加剧，脊柱结核的发病率也不断的增高，严重的影响了我国人民的生命健康[4,5]。
脊柱结核属于肺外结核，结核菌通过血液传播到易受损害、负重大的脊柱停留。脊柱具有肌肉附着点少、血流缓慢、松质骨多等特点，这些生理特点决定了脊柱是发病率最高的骨与关节结核，但只有20%的脊柱结核患者有典型的临床症状[6,7]。脊柱结核患者的临床症状是否典型决定于患者自身免疫系统是否健全。脊柱结核的临床症状主要表现为: 脊柱疼痛,后凸畸形，腹部肿块和脊髓神经压迫症状。结核菌感染的节段不同，其表现的临床症状也不同。颈椎结核患者主要表现为颈部疼痛、吞咽不适、上肢肌力减退和颈髓神经压迫症,患者常伴有肺部炎症，若不早期治疗会导致截瘫等严重并发症[8,9]。颈胸段脊柱结核的临床症状主要以脊髓神经压迫症状为主，伴发下肢麻木无力，后凸畸形，截瘫症状。腰椎和腰骶段结核的临床表现以腰痛为主。由于腰椎椎管较宽大，脊柱结核病程在此进展较慢,早期不易发现，等到出现大范围的椎体破坏, 冷脓肿的形成，神经根受到压迫时，患者的临床症状才显著[10]。
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结论

1 本研究证实椎间盘组织中 ADAMTS-4 的表达情况与椎间盘结核性破坏有关，推测 ADAMTS-4 在脊柱结核椎间盘破坏的发病机制中发挥了重要的作用。研究证实退变性腰椎间盘组织的 ADAMTS-4 表达显著增高，ADAMTS-4 在椎间盘突出症的发病机制中发挥了重要的作用。
2 本研究证实椎间盘组织中 MMP-3，-8, -9, -13, -14 的表达情况与椎间盘结核性破坏有关，推测 MMP-3，-8, -9, -13, -14 在脊柱结核椎间盘破坏的发病机制中发挥了重要的作用。研究证实退变性腰椎间盘组织的MMP-3， -13, -14 表达显著增高，MMP-3，-13, -14 在椎间盘突出症的发病机制中发挥了重要的作用。
3 本次研究证实 MMP-8，-9，-13 在椎间盘结核性破坏的过程中发挥了协同作用。研究证实 MMP-3，-8，-9，-14 表达水平与椎间盘结核性破坏的严重程度具有相关性。
4 本研究证实结核性椎间盘组织中 MMP-3，-13 的表达情况与吸烟习惯有正相关性，推测吸烟是影响脊柱结核预后的不利因素。 本研究证实结核性椎间盘组织中 MMP-8, -9 ，-13 的表达情况与疼痛强度有正相关性，推测疼痛可能通过增加炎性反应的途径，加重脊柱结核病的病情。本研究证实结核性椎间盘组织中 MMP-9 ，-13 的表达情况与症状持续时间有相关性，推测症状持续时间长短是影响脊柱结核预后的相关因素。本研究证实结核性椎间盘组织中 MMP-8, -9 ，-13 的表达情况与 CRP 有正相关性，推测高水平的 CRP 是影响脊柱结核预后的不利因素。本研究证实结核性椎间盘组织中 MMP-8, -9 ，-13 的表达情况与 ESR 有正相关性，推测高水平的 ESR是影响脊柱结核预后的不利因素。
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参考文献：

[1] Jacopo Giuliani,Benedetta Urbini.  Spinal tuberculosis simulating metastatic malignancy:An unusual condition[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 2014(01)
[2] 梁莉,乐军,刘丽蓉,韩敏,唐神结,肖和平.  MMP-1基因1G/2G多态性在支气管结核狭窄中的作用[J]. 中华医院感染学杂志. 2012(11)
[3] 刘敏.  MMP-3和MMP-7在良恶性胸腔积液中的表达及意义[J]. 中国现代医生. 2012(07)
[4] 郭立新,马远征,李宏伟,薛海滨,彭伟,罗小波.  脊柱结核围手术期ESR及CRP多样性临床分析[J]. 中国骨伤. 2010(03)
[5] 秦超,刘维钢.  Cathepsin L与MMP-3在兔椎间盘退变中相关性研究[J]. 现代生物医学进展. 2009(21)
[6] 张固琴,胡苏萍.  TGF-β1,TNF-α和MMP-9在人结核性淋巴结中的表达及临床意义[J]. 武汉大学学报(医学版). 2008(05)
[7] 王心静,王巍,叶一秀,王卫,孟祥红.  结核性脑膜炎患者脑脊液基质金属蛋白酶-9及其抑制剂检测[J]. 实用医学杂志. 2007(16)

 

本文编号：11040