以LSC为靶标的复方浙贝颗粒抗AML临床研究

【摘要】 本文由两部分组成,通过两篇文献综述回顾了白血病干细胞(leukemia stem cell,LSC)具有自我更新和无限增殖潜能,是造成白血病发生发展的根源。而且LSC处于静止期,对化疗药物不敏感,易产生对多种化疗药物的交叉耐药,一般细胞周期化疗药物很难对其发挥杀伤效果。加之LSC集中于药物难以达到的骨髓区域以及具有天然耐药特性,正好逃逸了抗癌药物的攻击,为急性白血病复发潜伏了祸根。当多数白血病患者处于临床完全缓解状态时,体内仍残留包括LSC在内的微小残留病灶会重新活跃进入细胞分裂周期,并很快自我更新,无限增殖,造成急性白血病复发。临床观察还发现,部分难治性急性白血病患者一旦使用化疗既会出现严重的骨髓抑制,但停药后外周血或骨髓却很快显现大量的白血病细胞,且具有耐药相关蛋白高表达特征,支持LSC具有高度增殖潜能与多药耐药的生物学特征。因此针对LSC源头上的靶向干预治疗是克服白血病多药耐药最有效途径。我们前期研究发现,复方浙贝颗粒联合化疗能够提高难治性急性白血病患者临床缓解率,效应机制与诱导细胞凋亡、降低膜耐药蛋白高表达、调节酶异常变化相关,但均以白血病细胞为靶标,是否能针对LSC起到逆转耐药效应缺乏深入研究。临床研究主要为：1.研究目的通过观察复方浙贝颗粒联合化疗对难治性急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)患者骨髓LSC表面分子标志物的影响及难治性AML患者白血病细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路和NF-κB信号通路中相关分子标记物(PI3K、mTOR、PTEN、 NF-κB)与骨髓周围微环境相互作用的细胞表面标记物CD44表达变化,试图明确复方浙贝颗粒逆转多药耐药效应靶点。2.研究方法全部病例资料来自北京中医药大学东直门医院血液肿瘤科,北京大学人民医院血液科,廊坊市中医医院血液科于2011年12月至2013年8月观察的难治性AML患者。治疗采用化疗方案有HAE, MA, CAG, AA, EA, FLAG等,复方浙贝颗粒(浙贝母12克,川芎9克,防已9克)由北京康仁堂药业有限公司制成中药配方颗粒,于化疗前3天开始服用复方浙贝颗粒,每次1袋,每日2次,共服用14天,21天为一疗程。以流式细胞术分别检测骨髓有核细胞中LSC表面分子标志物(CD34+CD123+、 CD33+CD123+)细胞表达比例。有30例患者完成治疗前后对照,分别检测了2次LSC表达比例；另外23例患者仅检测了1次LSC表达比例。20例次在北京中医药大学东直门医院血液肿瘤科住院的难治性AML患者行骨髓活检术采集组织标本,以免疫组化技术检测了CD44、PI3K、mTOR、PTEN、NF-κB表达情况。3.研究结果①难治AML中CD34+与CD33+CD123+细胞比例分别为11.78%、12.86%,两者相关性分析显示相关系数为0.953,两者具有明显相关性(p<0.001)。②按诊疗标准分类将难治性AML分为两组,其中处于缓解状态时患者的LSC表达比例分别为0.66%,0.92%,较处于复发状态时LSC比例(20.73%,22.47%)明显降低,差异具有统计学意义(p<0.001)。③30例完成前后治疗对照的难治性AML患者治疗后LSC表面分子标志物细胞表达比例(5.49%,5.94%)较治疗前明显降低(17.05%,17.71%),差异有统计学意义(p<0.05)。其中25例处于复发状态时完成治疗前后对照的患者进一步分析发现,治疗后LSC比例(6.82%,7.39%)也较治疗前LSC比例(21.74%,22.48%)明显降低,差异有统计学意义(p<0.01)。治疗后达到完全缓解有10例患者(有效率40%),且LSC表面分子标志物细胞表达比例分别为1.50%,1.65%,较未缓解患者明显下降(11.65%,12.61%),差异具有统计学意义(p<0.01)。④20例取骨髓活检患者中9例处于完全缓解的白血病细胞相关分子标记物CD44、PI3K、mTOR.PTEN.NF-κB阳性细胞表达率分别为22.2%、0%、33.3%、33.3%、77.8%,与11例未缓解的63.6%、0%、18.2%、63.6%、90.9%相比,CD44表达差异有统计学意义(p<0.05),阳性表达强度也提示CD44表达在两组间有统计学差异。完全缓解的白血病细胞相关分子标记物CD44.PI3K.mTOR.PTEN.NFκB平均光密度分别为441.78、217.28、393.58、91.16、642.66,与未缓解的840.06、316.21、223.00、292.51、775.35相比,CD44表达差异有统计学意义(p<0.05)。4.研究结论①CD34’CD123+与CD33+CD123+细胞具有显著相关,可以用来定位LSC。②LSC比例可以反映急性白血病患者是否处于持续缓解状态。③复方浙贝颗粒是通过降低LSC表面分子标记物CD123、CD33表达比例,提高了难治性AML化疗缓解率。④白血病细胞中CD44高表达可作为难治性AML预后判定的重要参考指标,PI3K/Akt/mTOR信号通路和NF-κB信号通路在白血病细胞中的作用需要进一步研究。 

综述一白血病干细胞研究概述

1白血病干细胞的发现
胖瘤干细胞(cancer Stem cell, CSC)是目前临床研究的热点之一。多年的临床观察和实验研究发现，虽然白血病细胞具有高度恶性，但大部分恶性细胞只能在体内增殖，只有少量恶性细胞可在体外形成克隆生长。而且尽管所有恶性细胞的形态十分相似，其生物学特性却存在很大差别。这都反映白血病患者体内可能存在着CSC。CSC是白血病的起始细胞，它们在白血病的发生发展、复发和耐药中起着重要的作用⑴。这群细胞可以移植到非肥胖性糖尿病严重联合免疫缺陷（nonobesediabetic/severe combined immune deficient, NOD/SCID)小鼠体内，诱导产生白血病，这也是目前鉴定CSC常用的实验方法⑴。1994年，Lapidot等发现大部分急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML)细胞只有有限的增殖能力，表明可能在白血病克隆里面存在着一群数量极少且具有无限增殖能力的干细胞，通过将白血病细胞移植给NOD/SCID小氣来鉴定AML启动细胞，最后发现能在NOD/SCID小鼠体内产生大量集落形成祖细胞的是CD34+CD38-细胞，这群细胞描述为‘‘SCID鼠人类白血病启动细胞”（SCID leukaemia Lniat ing cell SL-IC )。1997 年 Bonnet 等通过大量的临床样本研究发现，在急性髓细胞白血病患者中仅有〔034++0038_细胞亚群具有自我更新和复制能力，虽然该类细胞亚群数量很少，但它们却是唯一能将急性髓系白血病细胞在动物体内繁衍复制继承下来，这群白血病细胞被定义为“白血病干细胞（leukemia stem cell，LSC) ，并提出形成白血病的万恶之源就是从此LSC的存在越来越多地获得人们的公认。
动物实验研究显示，接种在小鼠体内LSC所产生的大部分白血病细胞均为CD38+、HLA-Dir细胞，这些都是干细胞分化后产生的特异性表面标记细胞，表明LSC具有能向下游阶段分化成熟的能力。局限稀释法测定LSC的含量为0. 25%-1. 00%,而在接种LSC后的小鼠体内可以检测出n的保持CD34+CD38^性细胞，表明LSC在体内进行了大量扩增，说明LSC具有自我更新能力。因此同正常造血干细胞(hematopoietic stein eel 1, HSC)—样，LSC也具有自我复制，增殖潜能，多向分化能力等特点。正常HSC可通过不对称分裂产生两个子代细胞，一个仍然维持母代即HSC的特征，另一个则分化为前体细胞，前体细胞在有丝分裂过程逐渐丧失增殖能力，最终分化为各系血细胞，而LSC分化产生的是一个是维持LSC特征，另一个则为白血病原始细胞，，向下分化产生白血病细胞。
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2白血病干细胞的起源
尽管LSC既能自我更新和无限增殖，生存时间相对较长，具有许多与HSC相同的特征，但是关于LSC的来源仍存在很多争议。现代研究表明白血病的发生是在多种致病因素打击下，白血病细胞累积点突变、基因重排或染色体易位等多个突变的综合作用，最终恶性转变成具有自我更新能力和增生、生存优势的LSC，这是一个多阶段、多步骚过程。因此LSC是多重因素累积突变后的结果。动物实验研究显示，转染了 PML/RARa融合基因的鼠模型并不能立即发生白血病，需要经过较长潜伏期，才会出现白血病，而在RAR a阳性的HSC中加入Pim2 (proviral integration site ofmurine 2)蛋白，则可以明显缩短小鼠发生白血病潜伏期，单一 RARa蛋白或Pim2蛋白都不能在小鼠体内诱导产生白血病_，表明LSC产生一般是由两次或多次癌性突变产生后的结果。因此推测LSC形成的三种模式为：①HSC发生第一次突变形成前LSC，然后前LSC继发第二次突变最终产生LSC,是由正常HSC突变产生LSC;②HSC发生突变后分化形成白Jfe病前期祖细胞，白血病前期祖细胞再发生第二次突变诱导产生LSC;③HSC正常分化形成造血祖细胞，但是受两次突变打击后产生LSC""，由此对于LSC起源有几种不同认识。
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综述二中药逆转白血病多药耐药研究

1白血病多药耐药机制及治疗措施
多药耐药(multidrug resistance, MDR)产生机制以及如何克服白血病多药耐药一直是国内外血液界研究的热点课题。MDR发生是多因素、多机制共同作用的结局，目前，已经明确的白血病多药耐药机制主要有以下几种：①耐药蛋白高表达：在耐药的白血病细胞膜上存在有多种转运蛋白，这些转运蛋白高表达可以导致白血病细胞的多药耐药，如P-糖蛋白、多药耐药性相关蛋白、肺耐药相关蛋白等。其共性特征是这些转运蛋白通过主动转运功能将化疗药物系出细胞外，从而降低了细胞内抗癌药物浓度，使白血病细胞能够逃逸抗癌药物对其杀伤效果。②相关酶变化：在白血病治疗过程中，白血病细胞内许多酶发生了异常改变，如蛋白激酶C、DNA拓扑异构酶11、谷胱甘肽等，蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)是一种丝苏氣酸蛋白激酶，活化后可作用于细胞核中的转录因子，促进细胞的增殖和分化。在多药耐药的胖瘤细胞中，多药耐药基因的高表达可导致Pgp活性井高，而通过Pgp的碟酸化可激活PKC，导致细胞对化疗药物抵抗，从而引起胖瘤细胞的多药耐药；TopoII是DNA进行复制必需的核畴，在细胞内还参与基因的重组、转录及DNA修复等功能，同时也是许多化疗药物抗癌乾点，抑制TopoII的活性可以引起DM断裂增加引起细胞调亡，而细胞内TopoII含量的减少或者活性降低，导致抗癌药物的作用耗点减少，诱导细胞抵抗药物的敏感性，产生多药耐药活性。谷胱甘肽是细胞内解毒系统的重要组成部分，在谷胱甘肽-S-转移酶催化下，GSH可与多种抗脾瘤药物结合，导致其水溶性增加，使药物易于被细胞排泄到胞外，降低抗癌药物的浓度，使对白血病细胞的杀伤减弱。③DM修复功能异常：DM损伤修复是细胞自身保护反应。多数抗癌药物是通过损伤DNA诱导细胞调亡发挥抗肿瘤活性的，而细胞本身也可通过自身修复机制抵抗化疗药物的伤害，其功能增强导致白血病细胞对化疗药产生拮抗，引发细胞多药耐药的产生。④细胞调亡受抑制：恶性胖瘤的产生与细胞过度增殖，调亡障碍等明显相关，在白血病细胞体内常存在着与细胞调亡调控的相关基因及其蛋白（BCL-2、BAX、FAS、FASL)异常表达，这些改变使白血病如胞调亡受阻，对抗癌药物也不敏感，产生细胞多药耐药的特性。⑤其他机制，如细胞膜功能改变影响药物的转运和外排；激素受体量和亲合力改变等也与白血病多药耐药密切相关。
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2白血病干细胞多药耐药机制
传统化疗药物根本无法根除LSC是导致白血病复发的重要原因。由于LSC具有处于静止期，自我更新，表达多药耐药蛋白，抗揭亡能力等生物学特征，使得LSC能够逃避化疗药物的损害，在白血病复发和耐药中起到关键的作用。通过对白血病干细胞耐药机制的深入了解，有助于提高抗癌药物的敏感性，进一步提高抗白i病治疗的临床疗效，而且还可以发现新的抗白血病治疗措施，为根治白血病带来希望。白血病干细胞的多药耐药机制主要与以下因素相关：
2.1 LSC处于静止期
目前临床上所应用的抗胖瘤药物大多针对处于分裂期的恶性脾瘤细胞，以破坏细胞复制来达到抗脾瘤治疗的效果，对处于静止状态的细胞，通常不能形成有效伤害。Dean等研究认为具有自我更新能力的白血病干细胞通常都处于静止状态，其在细胞周期中为GO期，能够躲避化疗药物的伤害"=。王颖超等从人单核细胞白血病THP-1细胞中提取的CD34+CD38-LSC其细胞周期G0/G1期比例达94. 63%,进一步证明白血病干细胞处于不分离状态1”。刘俊等从K562细胞株中检测到的CD34+细胞群的G0/G1期细胞比例达80%左右。由此可见LSC通常处于细胞周期之外的休眠状态。充分表明白血病干细胞处于静止状态可以造成细胞多药耐药。
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临床研究 .......................46-66 
第一部分 复方浙贝颗粒联合化疗对AML干细胞影响的临床观察.............. 46-60 
前言........................ 46 
临床资料 ........................46-47 
诊疗标准 ...........................47-48 
结果 ...............48-55 
讨论.......................... 55-60 

第二部分 急性髓系白血病患者骨髓细胞相关分子标志物表达研究

前言
AML是发生在骨髓组织中的恶性肿瘤，与骨髓造血微环境有着密切关系，恶性细胞在骨髓腔内大量增殖、调亡障碍和分化受阻，从而影响了骨髓正常造血功能，在临床上表现为感染、发热、贫iL、出血等症状。研究巳经证实LSC在急性白血病发生、复发和耐药中起着关键作用。一方面在于LSC自身异常的信号传导通路，使得LSC可以实现自我更新、无限增殖；还有LSC周围微环境也为细胞生存和发育提供重要的庇护场所，参与介导白血病复发和耐药。因此LSC内持续激活的信号传导通路和与周围微环境之间的相互关系，导致AML难以通过化疗达到持续缓解，通过前一部分研究显示复发浙贝颗粒联合化疗可以杀伤LSC,为进一步研究疗效机制，我们通过检测难治性AML患者体内骨髓细胞自身信号传导通路及其与周围环境相互关系，明确其作用乾点。
临床资料
1病例来源
2011年12月至2013年3月在北京中医药大学东直门医院血液J!中瘤科共收集20例符合复发难治性急性白血病患者。依据急性白血病疗效评价标准将患者分为临床缓解组（9例），未缓解组（11例）。两组病例入院时基本信息见表1，表2。
2研究方法
2.1试刻与仪器
超敏SP试劍盒（Kit-9710)、即用型兔抗NF-kappaB多克隆抗体及DAB显色试刹盒购于福建迈新生物工程公司；兔抗人PnK多克隆抗体、抗PTEN多克隆抗体及抗CD44单抗均购自此京中杉金桥生物技术有限公司；mTOR抗体购自美国San t Cruze公司；SPOT11 数码成像系统（Diagnostic Instruments 公司产品）；Image pro plus 6.0 免疫组化彩色图象分析系统（Media Cybernet ics公司）。
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结论

①CD34+CD123+与CD33+CD123+细胞具有显著相关，可以用来定位LSC。
②LSC比例可以反映急性白血病患者是否处于持续缓解状态。
③复方浙贝颗粒是通过降低LSC表面分子标记物CD123、CD33表达比例，提高了难治性AML化疗缓解率。
④白血病细胞中CD44高表达可作为难治性AML预后判定的重要参考指标，P13K/ Ak t /mTOR信号通路和NF- k B信号通路在白血病细胞中的作用需要进一步研究。
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参考文献（略）