慢性压迫性神经痛大鼠脊髓水平Reelin表达变化

【摘要】 目的以大鼠坐骨神经的慢性压迫性损伤（chronic constriction injury，CCI）为疼痛模型，观察大鼠脊髓水平Reelin的表达变化情况，探讨其与神经病理性疼痛的相关性。方法雄性SD大鼠132只，体重250-350g，采用随机设计分为2组：假手术组（Sham组，n=48）、慢性压迫性损伤组（CCI组，n=84）。Sham组予暴露右侧坐骨神经主干不结扎，CCI组予建立右侧坐骨神经慢性压迫损伤模型。各组大鼠均于术前1天、术后1d、4d、7d、10d、14d、21d、28d测量双侧后足底痛行为学指标，包括机械缩足阈值（paw withdrawal mechanical threshold, PWMT）和热缩足潜伏期（pawwithdrawal thermal latency, PWTL）。留取大鼠腰段脊髓组织，采用RT-PCR、Westernblot检测脊髓背角Reelin mRNA、Reelin蛋白表达量随时间的表达变化；。结果1.疼痛行为学变化：各组大鼠术前PWMT和PWTL差异无显著性；Sham组术前与术后PWMT和PWTL差异无统计学意义；而CCI组术后各时间点PWMT和PWTL均出现不同程度降低（P＜0.01）。2. RT-PCR结果显示：与Sham组相比，Reelin mRNA在腰段脊髓背角水平的表达量从CCI术后第4天开始减少（P <0.05），第7天至28天出现显著的下降（P<0.01）；双变量相关分析显示：大鼠脊髓背角Reelin mRNA表达量与其PWMT呈正相关（rp=0.795，P <0.05），前者与其PWTL呈正相关（rp=0.845，P <0.01）。3. Western blot结果显示：与Sham组相比，Reelin蛋白在脊髓背角的表达量从CCI术后第4天开始减少（P <0.05），第7，10天显著下降（P <0.01），第14，21，28天继续降低（P <0.01）；双变量相关分析显示：大鼠脊髓背角Reelin蛋白表达量与其PWMT呈正相关（rs=0.746，P <0.05），前者与其PWTL呈正相关（rp=0.819，P <0.05）。结论慢性压迫性神经痛大鼠脊髓水平Reelin的表达下调，且这种变化与神经痛的严重程度呈正相关，Reelin表达变化可能对慢性压迫性神经痛的产生或发展有重要意义。 

前 言

坐骨神经痛（Sciatica）是一种常见的神经病理性疼痛（neuropathic pain），其治疗一直是困扰临床医生的难题。最常见病因为腰椎间盘突出，以及血管压迫、感染或恶性肿瘤等其他原因，但其发病机理尚未明确。病人常表现为下肢剧烈放射性疼痛 (Radiating pain)、间歇性跛行 (Intermittent claudication)、自发性痛 (Spontaneouspain) 和痛觉过敏 (Hyperalgesia) 等症状，约有 1/3 的患者这些症状会持续 2 年以上，严重影响了生活质量，也更易导致病人失去工作能力并耗费更多的医疗资源[1,2]。因此对坐骨神经痛的病生机制的研究，对寻找其治疗的理想途径有着重要意义。Reelin 是一种细胞外基质糖蛋白，最早发现于对 Reeler 鼠的研究，这种基因突变鼠因为无法编码表达 Reelin 导致大脑皮层发育异常，而出现共济失调等异常行为[3]。胚胎期主要由 Cajal–Retzius 细胞合成和分泌，Reelin-Dab1 信号通路在大脑发育过程中对神经元迁移、定位发挥了关键的作用。后来发现在神经细胞迁徙完成后，Cajal–Retzius 细胞几乎完全消失，但 Reelin 仍持续存在发育成熟的大脑中，且主要由γ-氨基丁酸能神经元（GABAergic neurons）分泌[4]，Reelin 表达异常与阿兹默海病、精神分裂症和双向情感障碍等神经系统疾病相关[5]，Reelin 在维持大脑功能稳定方面的作用一直是研究的焦点。
近来研究发现 Reeler 鼠脊髓背角（spinal dorsal horn）的第Ⅰ—Ⅲ板层神经元的定位出现异常，此处是收集和处理 Aδ和 C 伤害性感受器的传入纤维传入信息的中枢，进一步的行为学测试，发现 Reeler 鼠的感觉也存在异常，表现为对机械刺激的敏感度下降，而对热辐射刺激敏感程度上升[6,7]。另外，Reelin 可以通过调节 N-甲基- D-天冬氨酸受体 ( N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)的构型来改变其功能[8,9]，NMDAR 介导的突触后膜胞浆内 Ca2+增加，被认为是脊髓水平中枢敏化机制的关键，中枢敏化是慢性疼痛的重要机制之一[10]。综上，可以推测 Reelin 很可能参与脊髓水平的疼痛反应的调节，而国内外关于Reelin 的这一作用尚未见报道，为了证明 Reelin 在坐骨神经痛的过程中发挥了作用，本研究以大鼠坐骨神经的慢性压迫性损伤（chronic constriction injury，CCI）为疼痛模型，，观察大鼠脊髓水平 Reelin 的表达有无改变。
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材料与方法

1 材料

2 方法
2.1 实验动物 清洁级雄性Sprague Dawley (SD)大鼠，体重250~350 g，由南华大学动物部提供。每笼四只，昼夜节律为12 h–12 h，室温为22 ± 2°C，自由进食和取水。所有的实验都经过南华大学医学院动物保护和使用协会批准，参照实验动物使用指南[11]，尽力减少实验动物伤害，并尽量减少动物使用数量。
2.2 CCI 模型的制备 SD大鼠腹腔注射戊巴比妥（40mg / kg）麻醉后，按Bennet 和 Xie方法[12]制作CCI模型，俯卧位，消毒，铺巾，选择右后肢，在股骨下方约l cm平行于股骨切开皮肤，用小剥离子经股二头肌间隙钝性分离肌肉，暴露坐骨神经，用神经剥离子轻柔将坐骨神经与周围软组织分离。在坐骨神经分成三支前的主干部位游离神经7 mm 左右，在距神经起始处 ( 三支分叉处)上方2 mm处， 用4.0含铬羊肠线结扎坐骨神经4道，每道间隔约1 mm，使被结扎的神经长约4~5 mm。注意结扎的松紧度，以打结时可见肌肉轻微抽动为准；局部生理盐水冲洗，间断缝合肌肉筋膜、皮下组织以及皮肤（见图1）；术毕将大鼠放入鼠笼，于温暖、安静环境自由喂养；假手术组除不结扎坐骨神经外，其余同模型组；手术由同一人操作。

前 言........6
材料与方法.....7
结 果....... 17
讨 论....... 25
结 论....... 28
综 述....... 32

讨 论

本文主要证实了脊髓水平Reelin在慢性压迫性神经痛大鼠模型中的表达出现了下调。以往对 Reelin 的研究，关注大脑水平的神经功能紊乱的居多，一般集中在认知功能障碍或精神疾病，近来有少量报道发现脊髓板层中 Reelin 表达异常可引起痛觉过敏[6,15]，但尚未有研究阐释慢性压迫性神经痛与脊髓水平 Reelin 表达情况的关系。本文的研究成果不仅发掘了 Reelin 在神经病理性疼痛中可能存在的作用，也为探索慢性压迫性神经痛的发病机制提供了新思路。神经病理性疼痛的研究多数源于动物模型，尽管目前模型与临床实际情况仍存在差距。慢性病理性疼痛模型主要分为两大类：炎症性及神经源性。神经病理性疼痛的病理机制比较复杂，病变部位可从外周感受器一直延伸到脑。神经病理性疼痛一般伴有血管功能异常及炎症现象。CCI 模型是经典的神经病理性疼痛模型之一，于 1988 年被 Bennett 和 Xie 首次复制。CCI 大鼠疼痛模型表现为自发痛(自发抬起损伤肢体，时而舔足、咬足或甩足，避免损伤侧的负重)、痛觉过敏(机械痛敏和冷痛敏)、轻度或中度的自残现象。该模型术后第 2 天开始出现痛反应，10~14 d 达高峰，21d 以后开始逐渐恢复，持续 2个月后痛反应消失。因此本次实验选择术后第 1d、4d、7d、10d、14d、21d、28d检测 Reelin 表达改变，贯穿了 CCI 模型神经病理性疼痛的发生、高峰和恢复期。本实验结果显示在大鼠 CCI 模型中，Reelin mRNA 和 Reelin 蛋白与腰段脊髓背角的表达持续减少，且 Reelin mRNA 的最低值（CCI 术后第 10 天）出现在 Reelin蛋白减少高峰期（CCI 术后第 14 至 28 天）之前，由此可见 Reelin 的减少不太可能是消耗或丢失引起的，而应该与产生来源减少有关。
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结 论

慢性压迫性神经痛大鼠脊髓水平 Reelin 的表达下调，且这种变化与神经痛的严重程度呈正相关，Reelin 表达变化可能对慢性压迫性神经痛的产生或发展有重要意义。含 NR2B亚单位的 NMDARs（NR2B-NMDARs）具有：1. 对 Ca2+具有较高的选择通透性；2. 离子通道的衰减时间明显延长；3. 由其介导的兴奋性突触后电位(excitatorypostsynaptic potentials, EPSP) 也明显增加；4. 其与胞内的钙调蛋白激酶 CaMKⅡ的亲和力也较 NR2A 高[21]。NR2B-NMDARs 的离子通道特性决定了：NR2B 是调节NMDARs 诱导 LTP 的产生并引起中枢敏化和神经性疼痛的主要因素[22]。Reelin 一方面可以维持 NMDAR 中 NR2B 的低比例[9]，加速 NR2B 向 NR2A 的转变[23]，另一方面也可以通过抑制 GSK-3β来降低 NR2B-NMDAR 在突触上的稳定性[24]。因此Reelin 可能通过降低 NR2B-NMDAR 的数量和功能来减弱其在痛觉过敏中的促进作用。以上可能机制尚未有研究证实，Reelin 究竟是否参与了神经病理性疼痛的调节，是通过何种途径来发挥作用都需要进一步实验论证。
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参考文献（略）