次氯酸钠和紫外消毒对细菌抗生素抗性影响及其机制研究

发布时间：2020-04-07 11:24

【摘要】：目的:抗生素抗性细菌(Antibiotic resistant bacteria,ARB)严重威胁全球公共健康。为有效控制细菌抗生素抗性的产生及其传播速度,亟待发现导致ARB在环境中的产生和传播的可能因素并阐明其机理。传统的水消毒工艺并不能杀灭所有细菌,往往会有部分抵抗力较强的细菌残存,其中,部分细菌仍然保持未损伤状态存在,而部分细菌则会形成一种传统方法无法检测出的特殊生理状态细菌——亚致死损伤细菌。目前尚未见细菌的生理状态,尤其是损伤状态与抗生素抗性提高之间存在关联的文献报道。基于以上做出了细菌的损伤状态能够提高抗生素抗性这一假设。本课题的目的是研究消毒对细菌抗生素抗性的影响,验证细菌的损伤状态与抗生素抗性提高之间是否存在关联性并初步探讨其机制,为消毒促进水中抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes,ARGs)转移和传播的机制研究提供理论依据。方法:1.次氯酸钠暴露和UV照射对细菌抗生素抗性的影响:以铜绿假单胞菌为研究对象,采用不同剂量次氯酸钠或UV照射不同时间后,利用微量肉汤稀释法测定暴露后的细菌对13种代表性抗生素的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC);同时,采用可见光法检测暴露后细菌的CAT酶、GSH-PX酶和SOD酶等抗氧化酶活性;最后,使用Spearman秩相关分析损伤细菌浓度与抗生素MIC值之间的相关性。2.暴露后细菌提高抗生素抗性的机制:提取次氯酸钠暴露和UV照射后的细菌RNA并进行转录组学测序,通过差异表达分析,发现与细菌提高抗生素抗性有关的关键基因,并通过SYBR Green荧光定量PCR方法进行验证,最终提出消毒促进细菌提高抗生素抗性的可能机制。3.生活饮用水损伤细菌的抗生素抗性调研:分离生活饮用水中损伤细菌,通过16S rRNA测序或生化鉴定试剂盒进行菌株鉴定,并采用微量肉汤稀释法测定各分离株的MIC值。结果:1.4 mg/L次氯酸钠作用20 min的铜绿假单胞菌致死率为50%(半数致死剂量LD_(50)),该剂量下损伤细菌对氨苄西林(ampicillin,AMP)、氯霉素(chloramphenicol、CHL)、头孢他啶(ceftazidime,CAZ)的MIC分别提高2,2,5.6倍,且MIC值与LD_(50)下损伤细菌浓度成正相关;CAT酶、GSH-PX酶和SOD酶含量比暴露前提高了3.26,5.18,4.79倍;转录组学分析结果表明,细菌RND家族药物外排泵表达显著性上调的基因种类最多且mex EF-oprN相关基因上调最为明显,qPCR结果也验证了mex E、oprP基因表达上调。同时,2 mg/L、8 mg/L次氯酸钠作用20 min下的细菌致死率分别为20%、90%,但对MIC值均未见明显提高。2.经11mJ/cm~2 UV照射剂量暴露后,铜绿假单胞菌对四环素(tetracycline,TET)、环丙沙星(ciprofloxacin,CIP)、多粘菌素B(polymyxin b PLB)的MIC值分别提高了8.4,4.4,2倍;但MIC值与损伤细菌浓度无明显相关性;CAT酶、GSH-PX酶和SOD酶含量比UV暴露前提高了105.42,69.95,3.54倍;转录组学分析结果表明,细菌药物外排泵家族基因表达显著上调,qPCR结果验证了RND家族外排泵mexC表达上调。3.从12份自来水水样中,共计分离出150株损伤菌,涉及12个细菌种属,其中假单胞菌属最多,占38%。与质控菌相比,90%以上的损伤菌分离株表现出抗生素抗性增强,其中铜绿假单胞菌分离株对AMP、CHL、CAZ、TET、CIP、PB的MIC值均有所提高,且对CAZ的的MIC值提高倍数最大,达到了128倍。芽孢菌属出现了五重抗生素抗性。结论:1.次氯酸钠半致死剂量暴露下的铜绿假单胞菌可显著提高其抗生素抗性,且与其中的损伤细菌浓度显著相关。其机制可能主要与mexEF-oprN外排泵基因的表达上调有关。2.UV暴露可使铜绿假单胞菌的抗生素抗性提高,但与损伤细菌浓度无显著相关性。其机制主要与mexC外排泵家族基因表达上调有关。3.多数自来水中的损伤菌分离株对抗生素呈现较强抗性,假单胞菌属最多。上述研究结果表明,次氯酸钠消毒和UV消毒造成了细菌损伤,损伤细菌抗生素抗性增强,能够威胁饮用水安全。
【图文】：

流程图,转录组,信息分析,流程

图 2-1 转录组信息分析流程Figure 2-1 Pipeline of bioinformatics analysis2.2.2.8 关键差异表达基因的验证采用 SYBR Green 荧光定量 PCR 方法对转录组学分析中有完整基因注键差异表达基因进行验证。用 EZ-10 Spin Column 总 RNA 提取试剂盒提取RNA，样品为 4 mg/L 次氯酸钠暴露 1 min,5 min,20 min 的铜绿假单胞菌，为未暴露处理的细菌，步骤按照说明书进行。随后使用 PrimeScript IIcDNA 合成试剂盒反转录得到 cDNA。引物序列参照文献或委托宝生物公设计并分析其特异性。引物由宝生物公司合成。部分引物序列参照文献[42-2 所示。表 2-2 引物序列Table 2-2 The primers for SYBR Green qPCR基因序列 5'-3' 产物长度mexE-F ATCCGGCACCGCTGAAGGCTGCG 114mexE-R CGACAACGCCAAGGGCGAGTTCACC

次氯酸钠,暴露剂量,致死率,细菌

Ct(目的基因) － △Ct(标准值)；目的基因的相对表达为 2－ ΔΔCt。2.9 数据统计与分析菌的损伤率与致死率，MIC 值计算用 Excel 进行统计，抗氧化酶活性的处否有统计学差异的比较使用 SPSS 22.0 进行多个独立样本的单因素方差伤细菌浓度与对不同抗生素的 MIC 值之间的相关性使用 SPSS 22.0 进an 秩相关分析。2.3 结果1 次氯酸钠作用下的细菌存活规律与损伤细菌形成规律 2，，4，8 mg/L 的次氯酸钠作用下的铜绿假单胞菌的存活规律与损伤细菌如图 2-2，2-3 所示。
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R446.5

【参考文献】