急慢性炎症对腹膜透析患者预后的影响及可能监测和干预方法初探

发布时间：2020-04-11 06:10

【摘要】：研究背景腹膜透析(Peritonealdialysis,PD)是终末期肾病患者肾脏替代治疗的主要方式之一,腹透相关性腹膜炎(Peritoneal Dialysis Associated Peritonits,PDAP)是腹膜透析治疗常见的严重并发症。近年提出的PDAP短期预后不良直接影响PD患者的生存和技术生存,目前国内缺少该领域的研究。鼻腔应用抗生素改善鼻腔带菌状态可有效降低PD导管相关感染的发生率,但因为抗生素抵抗临床推广困难,目前尚无新的替代方法。PDAP影响腹膜结构与功能的机制研究受腹膜活检取材困难的限制,外泌体是活细胞主动分泌的结构,具有无创活检的优势,但缺乏腹透液外泌体的提取方法及应用经验。炎症通过改变免疫细胞及实质细胞的功能状态导致纤维化,但具体机制尚不清楚,已发现糖酵在IL1β诱导的肾脏纤维化,但对间皮细胞转分化的作用尚待观察。本研究回顾性分析PDAP短期预后不良及危险因素,初步观察鼻前庭定植菌管理对PDAP发生率的影响。同时尝试建立腹透液外泌体的提取方法,应用外泌体技术观察PD患者的炎症状态,细胞实验初步观察IL1β诱导的人腹膜间皮转分化过程中的糖酵解。研究目的1.观察腹透相关性腹膜炎的临床特征和危险因素,分析其对腹膜透析患者生存及技术生存的影响;2.观察腹透相关性腹膜炎的临床预后及短期预后不良的危险因素;分析高频腹膜炎的危险因素及长期生存与技术生存;3.建立超速离心法提取腹透液外泌体的方法,初步评价腹膜透析患者的炎症状态,观察IL1β诱导的糖酵解与人腹膜间皮细胞转分化的关系。研究方法第一部分腹透相关性腹膜炎危险因素及预后分析采用回顾性队列研究的方法,纳入2004年1月1日至2017年3月31日在北京协和医院腹膜透析中心开始接受腹透治疗的成年终末期肾脏病患者,收集基线一般资料、实验室指标和腹膜透析相关指标。·一般资料:人口学资料、临床粥样硬化性血管疾病等合并症、查尔森合并症指数;·实验室指标:血常规、肝肾功能、电解质等生化指标、hsCRP或NLR等炎症指标、ALB、HbA1c、UA、SI等营养及代谢指标。·腹膜透析相关指标:透析充分性、腹膜转运状态、标准蛋白分解率、是否发生腹透相关性腹膜炎及其临床特征;·其他:腹膜炎患者收集发生腹膜炎前3月内的实验室指标及透析相关指标。1.随访截止至2018年3月31日,以死亡为主要终点,技术失败为次要终点,记录患者的转归及原因。比较腹膜炎、无腹膜炎患者临床特征及长期生存,使用Kaplan-Meier法计算生存率、技术生存率,应用Cox比例风险模型分析影响腹膜透析患者生存和技术生存的独立危险因素;2.首次腹膜炎后随访4周截止至2017年4月30日,观察短期预后即4周内出现死亡、拔管转血液透析、持续性感染或复发的患者归入腹膜炎短期预后不良组,其余归入短期预后良好组,比较两组患者基线、腹膜炎发生前3月临床特征,Logistic回归模型分析腹膜炎短期预后不良的危险因素;3.对首次腹膜炎后存活且继续腹膜透析的腹膜炎患者,随访至2018年3月31日根据随访期内腹膜炎发生率的高低分为高频腹膜炎组(腹膜炎发生率0.5次/患者年)、低频腹膜炎组。观察鼻前庭定植菌检测及干预对腹膜炎发生率的影响,分析高频腹膜炎对患者腹膜功能及长期生存的影响。第二部分腹透液外泌体评价腹膜炎症状态方法建立及意义初探1.建立超速离心法提取腹透液外泌体的方法收集新鲜的腹透液,参考浆膜腔积液外泌体及本实验室尿液外泌体提取方法,尝试调整原液量、离心条件、应用滤器等因素,提取腹透液外泌体。对所提取样品进行负染色、透射电镜镜检观察形态;纳米颗粒跟踪分析技术检测样品中外泌体浓度及粒径分布;Western Blot法鉴定外泌体特异性标志物TSG101及CD63蛋白的表达,以鉴定外泌体提取是否成功。2.腹膜透析患者腹腔炎症状态初步观察反复离心法提取规律腹膜透析患者腹透液原代巨噬细胞,倒置显微镜观察其形态,免疫荧光CD68染色鉴定细胞表面标志物;免疫荧光法检测腹透液原代巨噬细胞NLRP3,Caspase1和IL1β的表达。收集2017年1月1日至2018年1月31日腹透相关性腹膜炎患者的腹透液、临床资料,按照年龄、透析龄匹配无腹膜炎的常规腹透患者,比较两组患者的临床特征,ELISA法测定腹透液IL1β;提取腹透液中的外泌体,Western Blot法检测两组患者腹透液外泌体NLRP3,Caspasel,IL1β及糖酵解通路酶水平。3.糖酵解参与IL1β诱导人腹膜间皮细胞转分化的初步观察DMEM/F12培养基体外培养人腹膜间皮细胞株(HMrSV5),形态学及免疫荧光法鉴定pan-Cytokeratin阳性,确认其具有腹膜间皮细胞的特征。不同浓度的IL1β与细胞共孵育,CCK-8、LDH释放试验方法检测细胞增殖与毒性,选择合适浓度的IL1β用于后续试验。比色法检测对照组和IL-1β刺激组细胞乳酸分泌量及细胞内ATP水平;免疫荧光及Western Blot法评估糖酵解通路关键酶Hexokinase Ⅱ、LDHA的水平,Western Blot检测α-SMA、波形蛋白(vimentin)、紧密连接蛋白Claudin1、纤连蛋白(Fibronectin,FN)的蛋白水平,评价IL1β对间皮细胞转分化和分泌细胞外基质的作用。研究结果1.腹透相关性腹膜炎危险因素及对长期技术生存的影响本中心553例腹膜透析患者中162例患者发生大于等于一次PDAP,腹膜炎发生率每77患者月1次。腹膜炎患者男女比例79:83,开始腹膜透析时平均年龄(58.5±15.7)岁,原发病主要为糖尿病肾病(34.0%)和慢性肾小球肾炎(16.0%)。发生腹透相关性腹膜炎时患者的平均年龄(61.0±15.9)岁,发生腹膜炎时中位腹膜透析时间为20.5(5.0,44.0)月,感染腹透液微生物培养阳性率56.8%,其中最常见致病菌为革兰氏阳性球菌(57.6%)。Logistic回归分析显示,合并临床粥样硬化性血管疾病(OR= 1.827,95%CI 1.138-2.934,P=0.013)、应用 Tenckhoff 管(OR=2.101,95%CI 1.022-4.319,P=0.044)是发生腹透相关性腹膜炎的独立危险因素。本中心腹透患者中位生存时间为67.0(60.1-73.9)月,Kaplan-Meier生存分析及Log Rank检验提示腹膜炎患者技术生存率显著低于无腹膜炎患者(χ2=10.753,P=0.003),生存率没有差异。多因素Cox回归模型显示,非老年(HR=1.903,95%CI 1.014-3.572,P=0.045)、高 BMI(HR=1.089,95%CI 1.013-1.172,P=0.022)、腹透相关性腹膜炎(HR=2.738,95%CI 1.552-4.829,P=0.001)是影响腹膜透析患者长期技术生存的独立危险因素。2.微炎症状态对腹透相关性腹膜炎的短期预后的影响162例腹透相关性腹膜炎患者中,55例(34.0%)发生短期预后不良,其中30.9%患者拔管转血液透析,29.1%的患者死亡,致病菌均以革兰氏阴性菌为主。与预后良好患者相比,短期预后不良患者发生合并临床粥样硬化性血管疾病的比例更高(49.1%比31.8%,P=0.031),发生腹透相关性腹膜炎前3月hsCRP水平升高(9.3mg/dl比3.6mg/dl,P=0.004),多种微生物和革兰氏阴性菌感染比例更高(15.6%比3.3%,P=0.039)。Logistic 回归分析显示,腹透龄1 年(OR=2.324,95%CI 1.080-5.003,P=0.031)、腹膜炎前高 hsCRP(OR=1.027,95%CI 1.002-1.052,P=0.031)是腹膜透析患者发生腹膜炎短期不良预后的独立危险因素。3.鼻前庭定植菌检测及干预降低高频发作腹膜炎、改善长期预后129例首次腹膜炎后继续腹透患者中,高频腹膜炎患者50例(38.8%),行鼻前庭定植菌检测及干预的比例显著低于低频腹膜炎组患者(70.0%比87.3%,P=0.015)。其他基线资料方面,除血尿酸较高、血CA125较低外,原发病类型、基线实验室指标、腹膜转运类型及腹透充分性指标与低频腹膜炎组无显著差异。随访至终点事件前,高频组患者4小时D/P肌酐显著高于低频组患者(0.74±0.11比0.68±0.10,P=0.005),相应的腹膜高转运的患者比例显著高于低频组(22.7%比10.3%,P0.017)。生存分析结果表明,高频腹透相关性腹膜炎患者生存率及技术生存率均显著低于低频腹膜炎组(P均0.001),其死亡和拔管的主要原因均为感染。Logistic 回归模型发现,基线血 UA 升高(OR=1.040,95%CI 1.008-1.073,P=0.014)是腹膜炎患者发生高频腹膜炎的独立危险因素,行鼻前庭定植菌检测及干预(OR=0.230,95%CI 0.086-0.617,P=0.004)可降低高频腹膜炎的风险。4.腹透液外泌体评价腹膜炎症状态方法建立及意义初探成功建立了超速离心法提取腹透液外泌体的方法,负染色后透射电镜观察到微囊泡结构,直径100nm左右;纳米颗粒跟踪分析结果样品中颗粒浓度为4.3×1010/ml;所检测颗粒的平均直径为136.0±61.1nm,直径为133.0nm的颗粒相对浓度值最高(2.7×106/ml);Western Blot法检测到外泌体标志性蛋白TSG101及CD63。免疫荧光法可检测到常规腹膜透析患者腹透液中部分巨噬细胞(CD68+)同时表达NLRP3,Caspase1,IL1β;腹膜炎患者腹透液IL1β水平显著高于常规腹透患者[63.3(9.4,67.6)比1.5(1.3,1.6),P=0.004]。两组患者腹透液外泌体中可检测到NLRP3,Caspase1,IL1β,经内对照TSG101校正后,腹膜炎患者腹透液外泌体NLRP3,Caspase1蛋白水平显著高于患者,同时,该组患者糖酵解通路酶HexokinaseⅡ、LDHA蛋白水平显著升高。5.糖酵解参与IL1β诱导人腹膜间皮细胞转分化的初步观察根据细胞增殖、毒性试验结果,选择1ng/ml的IL1β与间皮细胞共孵育后,比色法测细胞分泌乳酸减少、细胞内ATP产生增加,免疫荧光和western-blot证实细胞内糖酵解相关的酶Hexokinase Ⅱ、LDHA水平亦较对照组显著升高,伴随间皮细胞α-SMA蛋白、波形蛋白、纤连蛋白表达量显著增加,紧密连接蛋白Claudin1表达量显著降低,提示间皮细胞转分化。小结本研究条件下观察到1.腹透相关性腹膜炎是影响腹膜透析患者长期技术生存的独立危险因素,但不影响长期生存。开始透析时合并临床粥样硬化性血管疾病、应用Tenckhoff管是发生腹透相关性腹膜炎的独立危险因素;2.首次腹膜炎前高hsCRP和腹透龄大于1年是腹膜炎短期不良预后的独立危险因素,高频腹膜炎患者生存率和技术生存更低,随访终点时腹膜高转运比例显著升高,进入腹透时行鼻前庭定植菌管理有助于降低高频腹膜炎的发生;3.超速离心法可有效提取腹透液外泌体,腹透患者腹透液中巨噬细胞和外泌体中可检测到NLRP3,Caspase1,IL1β的表达,腹膜炎时腹透液中IL1β显著升高,腹透液外泌体中NLRP3,Caspase1表达上调。腹膜炎时腹透液外泌体糖酵解通路酶Hexokinase Ⅱ、LDHA显著上调,糖酵解途径可能参与IL1β诱导的腹膜间皮细胞转分化-纤维化过程。
【图文】：

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诊（随诊间期超过２个月）。患者入组流程图如图１．１．１所示。逡逑２００４年１月１日－２０１７年３月３１日逡逑在北京协和医院接受腹膜透析逡逑治疗患舍＇逡逑ｎ＝５９４逦逦逡逑病历资料不完整逡逑逦？邋或未规律随诊逡逑逦＾逦邋ｎ＝３８逡逑资料完整且规律随诊逦逦逡逑ｎ＝５５６逦逦逡逑逦逦邋未满１８周岁逡逑＝

腹膜透析,患者,状态,中位

逦中国医学科学院北京协和医学院博士研究生论文逦逡逑二、研究结果逡逑１．本组腹膜透析患者基本情况及基线资料逡逑５５３例纳入本研究的ＥＳＲＤ患者开始腹膜透析时平均年龄５７．９±１６．６岁，中位逡逑年龄６１．０（邋４６．５，７１．０邋）岁，女性患者４７．９％。原发病最常见为糖尿病肾病２００例（３６．２％），逡逑其次为慢性肾小球肾炎（１５８例，２８．６％）和高血压肾损害（１２２例，２２．１％）（如图逡逑１．１．２Ａ）。２４３例患者合并糖尿病，占４３．９％，而合并临床粥样硬化性血管疾病者１４６逡逑例（２６．４％，），，计算基线中位邋ＣＣＩ邋３．０邋（２．０，５．０）。逡逑９３．８％的腹膜透析管为鹅颈管（Ｓｗａｎ－ｎｅｃｋ），维持性腹膜透析方式为ＡＰＤ患者逡逑７７邋例（１３．４％），基线残余邋ＧＦＲ邋为邋３．３４邋（１．６８，邋５＿４７）邋ｍｌ／ｍｉｎ，中位残余尿量邋８５０逡逑（５００，１４００）邋ｍｌ，对应中位２４小时透析超滤量为４０４ｍｌ邋（１３ｍｌ，邋８５０ｍｌ）；基线腹膜逡逑转运状态主要为ＨＡ邋（５２．６％）和ＬＡ邋（３１．４％）（如图１．１．２Ｂ）；基线每周Ｋｔ／Ｖ邋２．３３逡逑（１．９９，２．７６），每周邋Ｃｃｒ７５．８邋（５９．４，９４．０）邋ｍｌ／（ｍｉｎ．ｌ＿７３ｍ２）。逡逑
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R692.5

【参考文献】