米诺环素对CCI大鼠的疼痛、焦虑、抑郁样行为的影响及机制研究

发布时间：2020-05-16 02:19

【摘要】：神经性疼痛(Neuropathic Pain,NP)由外周神经损伤病变所导致,在临床患者除痛觉症状外,常伴有焦虑或抑郁等一些不良情绪发生。海马和前额叶皮层与学习和记忆等脑高级认知功能密切相关,也参与痛觉感受和焦虑、抑郁等负面情绪的产生。以往研究报道,在慢性应激或腹腔注射LPS所导致的抑郁大鼠,海马小胶质细胞激活,NLRP3(nucleotide-binding oligomerization domain,leucine rich repeat and pyrin domain containing,核苷酸结合寡聚化结构域样受体3)、炎症因子IL-1β(interleukin-1β,白介素-1β)和IL-18(interleukin-18,白介素-18)表达上调。然而,海马CA1区注射米诺环素是否影响CCI(chronic constriction injury of the sciatic nerve,慢性坐骨神经缩窄性损伤)大鼠的疼痛、焦虑、抑郁样行为以及海马/前额叶NLRP3信号通路尚不清楚。因此,本实验观察:1)海马CA1区给予小胶质细胞活性抑制剂米诺环素对CCI大鼠热痛阈、焦虑、抑郁样行为的影响;2)海马CA1区给予米诺环素对CCI大鼠海马以及前额叶皮层Iba-1表达的影响;3)海马CA1区给予米诺环素对CCI大鼠海马以及前额叶皮层NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18表达的影响。目的:明确海马CA1区注射米诺环素是否可以通过影响海马及前额叶皮层小胶质细胞激活和NLRP3信号通路缓解CCI大鼠的疼痛及焦虑、抑郁样行为?方法:选用5-6周龄的SD大鼠,均进行海马CA1区置管。1.实验分组:SD大鼠,体质量240-280g,随机分3组(n=8):(1)假手术组(海马CA1区注射0.01M PBS);(2)CCI组(CCI+海马CA1区注射0.01M PBS);(3)米诺环素处理组(CCI+海马CA1区注射1、2、5、10和15μg/μL米诺环素)。假手术组仅暴露坐骨神经而不结扎;CCI组和米诺环素处理组大鼠CA1区置管后休息7 d,进行坐骨神经结扎。海马CA1区注射0.01M PBS或不同浓度的米诺环素(0.5μL,2次/日)。2.行为学检测:(1)在CCI术前1 d,术后第1、3、5、7、10、14d分别测定各组大鼠给药1 h后的TWL(thermal withdrawal latency,热缩足潜伏期值);(2)在CCI术前1 d、术后3、7、10和14 d分别进行大鼠SPT(Sucrose Preference Test,糖水偏好实验)、OFT(open field test,旷场实验)和EMP(elevated plus-maze test,高架十字迷宫实验),观察大鼠的焦虑或抑郁样行为变化。3.RTFQ-PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,实时荧光定量PCR)检测大鼠第7、14 d海马以及前额叶皮层NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18 m RNA表达;ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay,酶联免疫吸附实验)检测大鼠第7、14 d海马以及前额叶皮层IL-1β和IL-18含量;在第7 d处死大鼠,免疫组化观察大鼠海马及前额叶皮层Iba-1表达;WB(western blot,免疫印迹)检测CCI大鼠第7、14 d海马以及前额叶皮层NLRP3和Iba-1蛋白表达。结果:1.痛行为学检测:大鼠CCI术后第1 d检测到TWL下调。海马CA1区注射米诺环素(1、2、5、10和15μg/μL)1 h后明显抑制CCI大鼠TWL降低(P0.05)。与假手术组相比,CCI组术后第1 d,TWL下调明显(P0.05),可持续14 d(P0.05);与CCI模型组相比,海马给予不同浓度米诺环素组在3、5、7、10、14 d大鼠TWL明显延长(P0.05)。2.焦虑及抑郁样行为检测:CCI组术后7、10和14 d观察到糖水偏好下降,与假手术组相比,差异具有统计学意义(P0.05);与CCI组相比,海马注射米诺环素后第7 d和14 d后糖水偏好显著增加(P0.05)。旷场实验结果显示,与假手术组相比,CCI术后7 d旷场中央区域停留时间和移动距离明显下降(P0.05),在CCI术后10 d(P0.05)和14 d进一步下降(P0.05),于第14 d下降最为明显(P0.05);与CCI组相比,米诺环素处理组大鼠在中央区域停留时间和移动距离明显延长(P0.05)。高架十字迷宫实验结果显示,与假手术组相比,CCI术后7 d进入开放臂次数和开放臂停留时间明显下降(P0.05),在CCI术后10 d(P0.05)和14 d进一步下降(P0.05),第14 d下降最为明显。与CCI组相比,米诺环素处理组进入开放臂次数以及在开放臂停留时间明显增加(P0.05),差异具统计学意义。3.PCR结果显示,与假手术组相比,CCI术后7 d,大鼠海马及前额叶皮层NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18 m RNA表达明显上调(P0.05);在CCI术后第14 d,NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18 m RNA表达上升更为明显(P0.05)。与CCI组相比,海马注射米诺环素后明显抑制坐骨神经损伤7 d和14 d时海马及前额叶皮层NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18 m RNA表达上调(P0.05)。4.ELISA结果显示,假手术组大鼠海马及前额叶皮层,IL-1β和IL-18含量较低水平。与假手术组相比,CCI术后7 d及14 d,海马及前额叶皮层IL-1β和IL-18的表达明显升高,差异具有统计学意义(P0.05)。与CCI组相比,注射米诺环素明显抑制CCI大鼠7 d及14 d海马及前额叶皮层IL-1β和IL-18含量上升(P0.05)。5.IHC结果显示,与假手术组相比,CCI组大鼠海马CA1、CA3及齿状回以及前额叶皮层的Iba-1积分光密度明显增强(P0.05);与CCI组相比,海马注射米诺环素后CA1、CA3及齿状回以及前额叶皮层Iba-1积分光密度明显下降(P0.05)。6.WB结果显示,与假手术组相比,CCI组中大鼠海马以及前额叶皮层Iba-1及NLRP3表达明显上调(P0.05);与CCI组相比,海马注射米诺环素能够明显抑制海马以及前额叶皮层Iba-1以及NLRP3表达上调(P0.05)。结论:1.海马注射米诺环素可以明显抑制CCI大鼠疼痛及焦虑、抑郁样行为。2.海马注射米诺环素抑制海马和前额叶皮层小胶质细胞激活,下调NLRP3和Caspase-1表达,导致IL-1β和IL-18产生减少,从而产生镇痛及缓解焦虑、抑郁样行为的效应。
【图文】：

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图 1：海马注射米诺环素对 CCI 大鼠不同时期疼痛行为学影响Fig. 1 Effects of intra-hippocampal injection of minocycline on thermal withdrawal latency evoked bychronic constriction injury (CCI) in rats. Pain sensitivity was determined by measuring TWL on the daybefore CCI and on days 1, 3, 5, 7, 10, and 14 after nerve injury. All values represent mean ±SD (n=8).(A) Intra-hippocampal injection of minocycline exerted anti-hyperalgesic effect as early as 1 day afternerve injury. Statistically signifcant differences were observed at 0.5, 1, and 2 h after the administrationof minocycline (1, 2 and 5μg/μL:++P<0.01; 10 and 15μg/μL:+P<0.05). (B) Comparison of TWL in hindpaw of rats. After minocycline injection, the TWL in minocycline-treated CCI rats were significantlyhigher than in the vehicle-treated CCI rats. **P<0.01, compared with sham group.+P<0.05,++P<0.01,compared with CCI rats.3.3 米诺环素减轻 CCI 神经痛大鼠模型的焦虑以及抑郁样行为3.3.1 海马注射米诺环素（5μg/μL）对 CCI 大鼠糖水偏好的影响在 CCI 术前 1 d、CCI 术后 3、7、10 和 14 d 测定糖水偏好的变化。如 Fig.2 所

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图 2：海马注射米诺环素对 CCI 大鼠不同时期糖水偏好的影响he effect of Minocycline on the sucrose consumption test after the CCI surgery. The sue decreased in the CCI depression group. Treatment with Minocycline （5μg/μL）) incrse preference on days 7, 10 and 14 after surgery. *P<0.05 means comparison with the P<0.05 means comparison with the CCI group (n= 8 per group) Sucrose consume (%) = sucrose consumption/ (sucrose + plain water consumption) ×100%.马注射米诺环素（5μg/μL）对 CCI 大鼠模型旷场实验行为学的影响果如 Fig.3 所示，，与假手术组相比，CCI 术后 3 d 旷场中央区域停留时间没有明显变化；但 CCI 术后 7 d 旷场中央区域停留时间和移动距离明显5），在 CCI 术后 10 d（P<0.05）和 14 d 进步下降（P<0.05），于第 14 明显。与 CCI 组相比，米诺环素处理组大鼠在中央区域停留时间和移动长，具有统计学意义（P<0.05）。
【学位授予单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R402

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