黄连素增强氟康唑对耐药白色念珠菌的作用机制研究及其生物信息学分析

发布时间：2020-05-20 21:00

【摘要】：目的本研究旨在研究中药黄连素(berberine,BBR)增强氟康唑(fluconazole,FLC)对耐药白色念珠菌的增敏作用及可能的机制,并通过全基因组测序分析获得耐药相关的基因及毒力因子,并进一步探讨中药BBR与FLC联合用药作用下抑制相关耐药基因且分析可能参与的信号途径和代谢通路。方法收集2015年1月-2016年6月宁医大总院住院标本24株,利用微生物检测仪及科马嘉鉴定菌种,根据NCCLS M44-A纸片扩散法筛选出耐药菌株并测定其抑菌圈直径;通过结晶紫染色测定菌株的产膜能力;采用微量棋盘稀释法来检测FLC与BBR的抗菌活性的MIC值;时间-杀菌曲线法测定BBR与FLC随时间变迁的杀菌效果及动态杀菌作用;采用荧光FITC-ConA染色观察菌株生物膜在药物作用下的生长形态;利用qRT-PCR检测目的基因CDR1、MDR、ALS3、ERG11、TUP1、HWP1的mRNA的表达变化;利用全基因组测序结果,分析KEGG代谢通路中麦角固醇ERG基因的在不同药物处理下的表达量变化。结果从临床尿管插管患者标本中分离出一株中产膜型FLC耐药白色念珠菌;结晶紫染色后可以观察到弱产膜菌以酵母样形式存在伴随着少量菌丝生长,中产膜菌株可见中等量的菌丝和酵母样菌落形成,而强产膜菌株大部分以菌丝相生长和少量微菌落;棋盘法测定,显示单用FLC药物治疗时对中产膜型耐药菌株的抑制率很低,当浓度达64μg/ml时抑制率仍40%,而单用FLC处理达到MIC60时用药为512μg/ml,BBR的加入使FLC药物浓度下降16个折点多,与单用FLC相比,差异有统计学意义(P0.05);利用qRT-PCR检测目的基因CDR1、MDR、ALS3、ERG11、TUP1、HWP1的mRNA的表达变化,在FLC与BBR联合用药时与单用FLC时相比明显降低(P0.05);根据水-烃两相分离的原理检测,显示,加入BBR后与单用FLC相比,细胞表面疏水性有所降低;针对测序结果,发现该基因组包含6276个基因,小卫星序列2384个,t RNA 144个,snRNA 32个,763个毒力相关的基因,通过系统发育树发现与菌株P3408的亲缘关系较近且核酸共线性较好;GO功能分类显示,该菌株的基因主要参与外排转运、细胞粘附、菌相转换、免疫应答等功能;KEGG统计图发现该菌株的代谢基因主要来自氨基酸与碳代谢,代谢通路图发现大量麦角固醇类ERG基因参与细胞膜固醇合成途径,可能与耐药有关,药物联用发现ERG1、ERG3、ERG4、ERG5、ERG6、ERG24、ERG25和ERG9基因有不同程度的升高或降低,与单用FLC相比,差异有统计学意义(P0.05)。结论(1)白色念珠菌经培养后形成生物膜,随着时间的延长其细胞及菌丝不断增多,生物膜形成明显(2)生物膜型白色念珠菌的不断成熟对FLC的耐药性增强,而加入BBR药物后可增强生物膜型耐药菌株对FLC的药物敏感性。(3)BBR增强FLC对产膜型耐药白色念珠菌的可能机制(1)降低外排泵基因CDR1、MDR1及粘附基因ALS3、HWP1的表达(2)增加进入胞内的药物浓度从而抑制了靶酶活性降低了ERG11基因的表达(3)菌丝阻遏物TUP1的过表达减少了生物膜的形成。(4)BBR可增强FLC降低白色念珠菌细胞膜固醇类蛋白基因的表达,提高菌株对药物的敏感性。
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R446.5

【参考文献】