全自动荧光定量PCR关键技术研究及其系统研制

发布时间：2020-06-01 10:34

【摘要】：荧光定量PCR是分子诊断市场占有率最高的检测项目,广泛应用于急诊、遗传、基因筛查、肿瘤癌症等领域。目前荧光定量PCR检测存在采用手工加样,样本前处理时间长,仪器升降温速率慢等缺点,且国产仪器性能不如国外品牌,在高端市场占有率少。因此,本课题针对免提取法试剂,提出基于磁动力切换恒温区进行核酸扩增循环的新思路,搭建全自动切换恒温区传热、微弱荧光检测一体化硬件测试平台,并通过荧光定量PCR试剂实验对本系统进行验证和测试,对提高检测周期、改进国产仪器性能、打破国外高端PCR检测技术的垄断有着重要研究意义。本文分析了荧光定量PCR仪的数学定量法和化学荧光探针法、化学荧光染料法原理,并对荧光定量PCR仪温控系统和光学系统等关键系统组成进行深入研究,分别对PCR过程温度需求、变温控制和荧光检测关键件的优缺点对比分析。本文创新性地提出了基于磁动力切换恒温区的温控系统,实现高精度的恒温控制,温控精度达±0.13℃,并应用热力学原理对反应液进行传热分析,使用COMSOL Multiphysics软件对反应液传热模型进行有限元仿真,得到反应液实际升降温信息。本文搭建了荧光共聚焦光学检测系统,将激发光路和检测光路集成聚集于检测点,采用515nm激光器激发和光电二极管检测580nm峰值波长。本课题使用SOLIDWORKS进行机械平台设计,搭建了高精度温控、运动控制平台和荧光共聚焦光学检测硬件系统,分别采用专家型PID算法和状态机判别算法实现高精度恒温和精确定位运动控制,连续动态采集了八通道的微弱荧光信号,并使用Visual Studio编写了人机交互界面。完成平台搭建后,本文针对温控、运动控制、光学系统进行了实验测试,实现±0.13℃精度的恒温温控、光学线性拟合度R2=0.992、精密度2%,并使用临床PCR试剂进行整机测试,成功测出阳性质控品和得到实时荧光标准S型曲线图。
【图文】：

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图 1.1-c Cepheid Smart Cycler 图 1.1-d Roche Light Cycler表 1-1 国外荧光定量 PCR 仪性能指标ABI 7500fast Roche LC 2.0 Bio-Rad CFX96 Strategen统 Peltier 半导体空气加热制冷 Peltier 半导体 Peltier 半率 3.5℃/s 15℃/s 3.3℃/s 2.5℃/s度 ±0.25℃ ± 0.4℃ ± 0.4℃ ±0.25℃卤钨灯，5 色激发，5色检测，CCD 检测LED( 单通道，470nm±10) 激发、PMT 检测6 色 LED 激发、光电二极管检测石英卤钨灯通道、PMT 500-660nm 530，560，610，640 ，670，705nm515-730 nm 350-700 96×（20～100uL） 32 ×(20ul，100ul) 96×（1～50uL） 96×（10～Fast-mode ：30~40min35 个循环 20ul 要30min ， 100ul 要55min 完成 40 个循环快速：50m

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厦门安普利：Anadas9850/ Genelight9800，广州达安基因：DA7600，杭州安杰思：AFD4800/9600（图1.2-d）等。总的来说，国产品牌在功能实现上可以达到与国外品牌相近，，但其核心技术研究还落后与国外厂商，仪器的控温精确度、荧光检测灵敏度等关键技术指标还与国外厂商存在不小的差距[8]，其性能指标及技术参数如下表 1-2 所示：
【学位授予单位】：深圳大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R440

【参考文献】