高钾灌注液对不同脑细胞缺血再灌注损伤模型的保护作用及其机制
发布时间:2020-06-04 03:36
【摘要】:研究背景和目的高钾灌注液对心肌缺血再灌注损伤有保护作用,但对脑的缺血再灌注损伤是否也有保护作用未有相关文献报道。前人的实验研究表明:使用氯化钾诱导大鼠发生心跳骤停,大鼠复苏后神经功能损伤较电刺激诱导心跳骤停的大鼠较轻。我们的临床观察发现:高血钾致病人心跳骤停时,即使经历较长时间的心肺复苏,一旦恢复自主循环,其留下的神经功能损伤相对较轻;我们的实验研究发现:经高钾预处理过的大鼠对缺血再灌注损伤的耐受性明显增加。然而对已经发生了缺血性损伤,在恢复血流时加入氯化钾,是否有减轻随后发生的再灌注损伤尚不清楚。本研究拟采用线栓法建立局灶性大脑缺血模型、采用改进的电刺激法建立心脏骤停模型,在恢复血流灌注时或实施心肺复苏时加用不同剂量的氯化钾,旨在验证高钾灌注液对于已经发生了缺血性损伤的神经细胞能否减轻其随后发生的再灌注损伤,探索有助于改进心脏骤停/心肺复苏后全脑缺血再灌注损伤的有效方法。方法1.采用大脑中动脉线栓法建立大鼠局灶性脑梗死模型。90min梗阻后恢复灌注,通过微量泵经颈静脉分别泵入2.5%、1.25%氯化钾溶(低剂量组和高剂量组)和生理盐水(盐水组),容量为3.2ml/Kg。2分钟后检测血清钾离子浓度。再灌注24小时后将所有存活动物取脑组织,通过检测TTC染色检测动物脑梗死面积,通过TUNEL染色检测脑组织凋亡指数,通过电镜观察梗死区域组织线粒体数量和分布密度、脑组织凋亡相关蛋白Cleave caspase-3/Casepase-3相对表达量、BCL-2/BAX相对表达量、p-CAMKII/CAMKII相对表达量、活性氧荧光强度、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、线粒体细胞色素C环氧化物酶活性、脑组织钙/钾含量、三磷酸腺苷水平、Na~+-K~+-ATP酶活性、Ca~(2+)-ATP酶活,从器官和分子生物学层面验证高钾灌注液能否减轻脑细胞的缺血后再灌注损伤。2.探索高钾灌注液对室颤动物模型心电和复苏效果的影响,为下一步研究复苏后全脑缺血再灌注损伤模型的稳定性奠定基础。应用经食道电刺激诱导室颤方法,建立心跳骤停时间为7分钟的心跳骤停/心肺复苏(cardiac arrest/cardio-pulmonary resuscitation,CA/CPR)大鼠模型,在复苏开始前30秒通过股静脉根据体重分别注入0.0024ml/g的生理盐水、1.25%的氯化钾溶液或2.5%的氯化钾溶液,观察在不同复苏方案(即心肺复苏方案一:胸外心脏按压+机械通气,但不除颤;心肺复苏方案二:胸外心脏按压+机械通气+除颤)下,不同浓度氯化钾对室颤大鼠的心电变化、复苏过程中的血压和复苏效果的影响。3.探索和建立一种心脏电刺激时间相同、心脏停止泵血的时间尽可能一致(全脑缺血时间相对一致)、复苏成功率相对较高的CA/CPR后全脑缺血再灌注损伤模型。主要是比较应用不同周龄大鼠的造模效果;比较应用传统的CA造模方法(电刺激的时间不固定)和改良CA造模方法(电刺激的时间固定60s,如果动物VF自动转复伴有血压回升,立刻实施胸外心脏持续挤压、使心脏不能舒张,达到无心排的目的)的造模效果。将实验动物分成四组:采用传统CA造模方法制作8周龄大鼠CA模型,根据复苏前动物心电类型将其分为室颤组(Ventricular fibrillation,VF组)和无脉性电活动组(Pulseless electrical activity group,PEA组);采用改良CA造模方法制作8周龄和24周龄的大鼠CA模型(改良法诱导CA的大鼠在复苏前心电活动均表现为PEA),分别定义为无脉性电活动低龄组(PEA+Y组)和无脉性电活动高龄组(PEA+O组)。观测指标:统计和检测以上四组大鼠复苏成功率、复苏后血压、脑损伤相关指标(神经功能评分、神经特异性烯醇化酶、活性氧水平、脑组织钙含量)以及肌钙蛋白-I含量。4.采用改良CA造模方法制作心肺复苏后全脑缺血再灌注损伤模型,复苏开始同时分别给予0.0024ml/g生理盐水(盐水组)、1.25%的氯化钾溶液(低剂量组)和2.5%的氯化钾溶液(高剂量组)。记录各组动物复苏成功率、恢复自主循环后24小时神经功能评分、神经特异性烯醇酶含量、脑组织钾/钙含量、脑组织三磷酸腺苷水平、脑组织Na~+-K~+-ATP酶活性和Ca~(2+)-ATP酶活性,验证高钾灌注液对复苏后全脑缺血再灌注损伤是否有保护作用并探索其机制。结果1.泵入氯化钾/生理盐水2分钟后,NS组动物血钾浓度(4.05±0.5mmol/L)与Sham组血钾浓度(4.25±0.2 mmol/L)比较未有统计学差异(p0.05);LD组和HD组血钾浓度较NS组升高,分别为4.76±0.3mmol/L和5.37±0.5mmol/L(p0.05)。四组动物心率结果显示Sham组为398±12.3beat/min,NS组为395±10.7 beat/min,LD组为340±23.1,HD组为beat/min331±40.4 beat/min。与Sham组对比,NS组未见有统计学差异;与NS组对比,LD组和HD组降低(p0.05)。四组动物平均动脉压分别为Sham组99±2.1 mmHg,NS组100±1.3 mmHg,LD组88±4.6 mmHg,HD组为84±2.1mmHg。与Sham组对比,NS组未见有差异;与NS组对比,LD组和HD组较低(p0.05)。再灌注24小时后,NS组的梗死面积较Sham组显著增大(21.39±6.3%vs 0);与NS组相比,LD组(13.32±5.5%)和HD组(8.13±3.1%)梗死面积减小(p0.05);HD组梗死面积也较LD组减小(p0.05)。NS组(42.35±3.47%)凋亡指数较Sham(8.74±1.11%)组显著升高(p0.01);与NS组对比,LD组32.67±2.95%(p0.05)和HD组(14.51±0.95%)凋亡指数下降(p0.01);而HD组凋亡指数也较LD组下降(p0.05)。再灌注24小时梗死区域cleave-caspase-3/caspase-3检测中,NS组较Sham组显著上调(p0.01);与NS组对比,LD组和HD组显著下降(p0.01);LD组和HD组之间差异不明显。在梗死区域组织凋亡相关蛋白BCL-2/BAX的数值检测中,NS组较Sham组显著降低(p0.01);与NS组对比,LD组表达升高(p0.05),HD组显著升高(p0.01);LD组HD之间差异不明显。在梗死区域组织蛋白p-CAMKII/CAMKII检测中,NS组较Sham组升高(p0.05);与NS组对比,HD组降低,虽然LD组有降低趋势,但未见有统计学差异。再灌注24小时梗死区域ROS检测中,NS组较Sham组显著升高(p0.01);与NS组对比,LD组和HD组ROS水平显著降低(p0.01);HD组较LD组下降水平也有统计学差异。再灌注24小时梗死区域电镜结果比较,NS组空泡结构较多,线粒体数量减少,内质网分布不均匀;与NS组对比,LD组和HD组空泡结构减少,线粒体数量增加,内质网分布较均匀。在MPTP开放性检测指标中,NS组荧光强度较Sham组显著下降,提示MPTP开放程度显著升高(p0.01);与NS组对比,LD组和HD组荧光强度升高,提示MPTP开放程度下降(p0.05);HD组开放程度较LD组低有统计学意义(p0.05)。在COX活性检测中,NS组较Sham组显著降低(p0.01);与NS组对比,LD组和HD组COX活性显著升高(p0.01);而HD组的COX活性升高幅度与LD组比也有显著统计学差异(p0.05)。在梗死区域钾含量检测中,NS组较Sham组降低(p0.05);与NS组对比,LD组和HD组脑组织钾含量升高(p0.05);LD组和HD组之间钾含量差异不明显。在脑组织钙离子含量检测中,NS组较Sham组显著升高(p0.01);与NS组对比,HD组钙含量显著下降(p0.05),而LD组随便有下降趋势但与NS组之间统计学差异不明显;HD组钙离子含量下降趋势较LD组有显著统计学差异(p0.01)。梗死区域脑组织ATP含量检测中,NS组较Sham组显著下降(p0.01);与NS组对比,LD组和HD组都有不同程度上升(p0.05);HD组较LD虽然有升高趋势,但未有统计学差异。在灌注24小时梗死区域脑组织MDA含量检测中,NS组较Sham组显著升高(p0.01);与NS组对比,LD组和HD组的MDA含量显著下降(p0.01);LD组和HD组之间MDA含量差异不明显。再灌注24小时梗死区域SOD活性检测中,NS组、LD组、HD组较Sham组降低(p0.05),但NS组、LD组、HD组之间未有统计学差异。再灌注24小时梗死区域脑组织Na~+-K~+-ATP酶活性检测中,NS组较Sham组显著下降(p0.01);与NS组对比,LD组和HD组Na~+-K~+-ATP酶活性显著上升(p0.01);LD组和HD组之间Na+-K+-ATP酶活性差异不明显。再灌注24小时梗死区域脑组织Ca~(2+)-ATP酶活性检测中,NS组较Sham组下降(p0.05);与NS组对比,LD组和HD组Ca~(2+)-ATP酶活性回升(p0.05);LD组和HD组之间Ca2+-ATP酶活性差异不明显。2.在心肺复苏方案一中,注射不同药物后各组动物由室颤转变为无脉性电活动的只数结果如下:NS组为0/18,LD组为0/18,MD组为8/18,HD组为18/18。室颤终止速度对比显示,HD组终止最快,之后依次为MD组、LD组和NS组。各组动物的复苏成功率分别为:NS组8/18(44.4%);LD组为10/18(55%);MD组为17/18(94.4%),;HD组为8/18(44.4%)。其中MD组依据注射药物后心电转变成为PEA和VF两类,根据心电类型将MD组细分为2个亚组:MD-PEA和MD-VF。MD-PEA组和MD-VF的复苏成功率为8/8(100%)和9/10(90%)。与NS组复苏时间(392.7±82.22 s)对比,LD组(256.7±56.18 s)、MD组(156.1±70.44s)、MD-PEA亚组(196.4±13.1s)和MD-VF亚组(125.0±44.91s)复苏时间较短;与LD组对比,MD组、MD-PEA组和MD-VF组复苏时间降低;与MD-PEA对比,MD-VF组复苏时间更低。复苏1小时后,各组动物平均动脉压整体趋势从高至低分别为LD组、MD组、HD组和NS组。与MD-PEA组相比,MD-VF组血压有升高趋势。注射药物后0分钟,三组动物室颤振幅无统计学差异。与NS组对比,LD组振幅在第3、第5和第7分钟均值都较高然而只有第7分钟有统计学差异,MD-VF组分别在第3、第5和第7分钟都较NS组升高且有统计学差异;与LD组对比,MD-VF组振幅均值在三个时间点都升高且有统计学差异。在心肺复苏方案二中,高剂量氯化钾溶液未纳入研究;而中剂量组中部分动物在注射KCL后能够维持室颤,定义为MD-VF-2组,盐水组和低剂量组在注射药物后所有动物均维持室颤,定义为NS-2和LD-2组。共三组动物纳入心肺复苏方案二研究中,分别为NS-2组、LD-2组和MD-VF-2组。三组动物中除颤成功率从高到低分别为MD-VF-2组、LD-2组和NS-2组,存在氯化钾剂量依赖关系。在平均除颤能量对比中,与NS-2组对比,MD-VF-2组平均除颤能量较低,有统计学差异;而LD-2组虽然存在降低的趋势,但未见有统计学差异。3.复苏成功率数据显示VF组为11/17(64.7%),PEA组为11/13(84.6%),PEA+Y组为13/15(86.7%),PEA+O组为12/20(60%)。四组动物的电刺激时间为:VF组90±8.6s,PEA组65.5±16.7s,PEA+Y和PEA+O组都为固定60秒。与VF组相比,PEA组刺激时间较少(p0.05)。与VF组相比,PEA组复苏时间显著降低;与PEA组对比,PEA+O复苏时间延长,PEA+Y组复苏时间未有统计学差异。四组动物平均动脉压趋势从高到低依次为PEA+Y组,PEA组,VF组和PEA+O组。四组动物恢复自主循环后24小时神经功能评分如下:NS组为68.75±1.66分,PEA组为75.4±1.0分,PEA+Y组为75.6±1.1分,PEA+O组为68±2.4分。其中Sham组为正常假手术组,得分为80分。与Sham组相比,VF组、PEA组、PEA+Y组和PEA+O组神经功能评分均有下降(p0.05)。此外,与VF组对比,PEA组和PEA+Y组神经功能评分较高(p0.05);与PEA+Y组相比,PEA+O组神经功能评分较低(p0.05)。PEA组和PEA+Y组之间未有统计学差异。各组动物恢复自主循环后24小时血液中神经特异性烯醇化酶含量结果如下:Sham组为0.44±0.03ng/ml,VF组为5.3±0.5ng/ml,PEA组为5.1±1.2 ng/ml,PEA+Y组为5.0±0.5ng/ml,PEA+O组为5.23±0.6 ng/ml。与Sham组对比,VF组、PEA组、PEA+Y组和PEA+O组神经特异性烯醇化酶水平有显著性升高(p0.01)。VF组、PEA组、PEA+Y组和PEA+O组之间未见有统计学差异。各组动物恢复自主循环24小时后活性氧检测荧光密度结果如下:Sham组为409±37.4,VF组为922±30.7,PEA组为807±19.9,PEA+Y组为800±17.0,PEA+O组为845±37.5。与Sham组对比,VF组、PEA组、PEA+Y组和PEA+O组活性氧水平显著升高(p0.01);与VF组对比,PEA组、PEA+Y组和PEA+O组活性氧水平降低(p0.05);与PEA+Y组对比,PEA+O组活性氧水平较高(p0.05)。恢复自主循环后24小时各组动物脑组织钙含量水平如下:Sham组为0.08±0.01mmol/mgprot,VF组为0.63±0.12 mmol/mgprot,PEA组为0.6±0.1mmol/mgprot,PEA+Y组为0.57±0.14 mmol/mgprot,PEA+O组为0.55±0.11mmol/mgprot。与Sham组对比,VF组、PEA组、PEA+Y组和PEA+O组脑组织钙含量均显著升高(p0.01)。VF组、PEA组、PEA+Y组和PEA+O组之间脑组织钙含量未有统计学差异。恢复自主循环后24小时各组动物血液肌钙蛋白-I含量结果如下:Sham组为0.001±0.008ng/ml,VF组为0.57±0.12ng/ml,PEA组为0.31±0.15 ng/ml,PEA+Y组为0.29±0.11 ng/ml,PEA+O组为0.37±0.09 ng/ml。与Sham组相比,VF组、PEA组、PEA+Y组和PEA+O组肌钙蛋白-I含量均有显著升高(p0.01);与VF组对比,PEA+Y组肌钙蛋白-I含量升高(p0.05),虽然PEA组和PEA+O组较VF组有降低趋势,但未见有统计学差异。4.各组复苏成功动物数分别为NS组11/15只,LD组为12/15只,MD组为14/15只。24小时神经功能评分结果为:Sham组79.5±0.5分,NS组74.5±2.1分,LD组77±1.1分,MD组为78.2±2.1。与Sham组对比,NS组24小时神经功能评分下降(p0.05);与NS组对比,LD组和MD组神经功能评分上升(p0.05)。LD组和MD组之间未见有统计学差异。恢复自主循环24小时后各组动物神经特异性烯醇化酶检测结果如下:Sham组为0.42±0.04ng/ml,NS组为5.2±1.4 ng/ml,LD组为3.9±0.4 ng/ml;MD组为3.0±0.2 ng/ml。与Sham组对比,NS组神经特异性烯醇化酶含量升高(p0.05);与NS组对比,LD组和MD组神经特异性烯醇化酶含量降低(p0.05);与LD对比,MD组神经特异性烯醇化酶含量降低(p0.05)。恢复自主循环24小时后各组动物脑组织钾离子含量结果如下:Sham组为0.96±0.10mmol/gprot,NS组为0.6±0.1 mmol/gprot,LD组为0.68±0.02mmol/gprot,MD组为0.74±0.04 mmol/gprot。与Sham组对比,NS组脑组织钾含量显著降低(p0.05);与NS组对比,MD组脑组织钾含量升高(p0.05),LD组脑组织钾含量虽然有升高趋势但未见有统计学差异(p0.05);与LD组对比,MD组脑组织钾含量升高(p0.05)恢复自主循环24小时后各组动物脑组织钙离子含量结果如下:Sham组为0.08±0.01mmol/mgprot,NS组为0.63±0.12 mmol/mgprot,LD组为0.60±0.11mmol/mgprot,MD组为0.55±0.09 mmol/mgprot。与Sham组对比,NS组脑组织钙含量显著升高(p0.05);与NS组对比,MD组脑组织钙含量降低(p0.05),而LD组脑组织钙含量虽然有下降趋势,但未见有统计学差异(p0.05);与LD组对比,虽然MD组脑组织钙含量虽然有下降趋势,但未见有统计学差异(p0.05)。恢复自主循环24小时后各组动物脑组织ATP含量结果如下:Sham组为410±14.0umol/gprot,NS组为281±20.1 umol/gprot,LD组为309±29.3 umol/gprot,MD组为342±14.5 umol/gprot。与Sham组对比,NS组脑组织ATP含量显著降低(p0.01);与NS组对比,MD组脑组织ATP含量升高(p0.05),LD组脑组织ATP含量虽然有升高趋势,但未见有统计学差异(p0.05);LD组和MD组之间脑组织含量差异不明显(p0.05)。恢复自主循环24小时后各组动物脑组织钠-钾-ATP酶(Na~+-K~+-ATP酶)活性结果如下:Sham组为3.95±0.12 U/mgprot,NS组为2.1±0.2U/mgprot,LD组为2.3±0.31 U/mgprot,HD组为2.7±0.1 U/mgprot。与Sham组对比,NS组脑组织Na~+-K~+-ATP酶活性显著下降(p0.01);与NS组对比,HD组Na~+-K~+-ATP酶活性升高(p0.05),LD组脑组织Na~+-K~+-ATP酶活性虽然有升高趋势,但未见有统计学差异(p0.05);与LD组对比,MD组脑组织Na~+-K~+-ATP酶活性升高(p0.05)。恢复自主循环24小时后各组动物脑组织钙-ATP酶(Ca~(2+)-ATP酶)活性结果如下:Sham组为5±0.3U/mgprot,NS组为3±0.13,LD组为3.1±0.4 U/mgprot,MD组为3.5±0.2 U/mgprot。与Sham组对比,NS组脑组织Ca~(2+)-ATP酶活性显著下降(p0.01);与NS组对比,MD组Ca~(2+)-ATP酶活性升高(p0.05),LD组Ca~(2+)-ATP酶虽然有升高趋势,但未见有统计学差异(p0.05);与LD组对比,MD组Ca~(2+)-ATP酶活性升高(p0.05)。结论1.在MCAO模型中,高钾灌注液能够减少大鼠24小时局灶缺血再灌注损伤,其机制与维持细胞内钾离子稳态、恢复线粒体功能、减轻钙超载和氧化应激损伤有关。2.在大鼠室颤心肺复苏模型中,适当浓度的高钾灌注液能够升高室颤振幅、促进室颤转复、减少除颤所需能量,提高大鼠心肺复苏成功率。3.采用固定电刺激时间加上胸部持续挤压建立大鼠心脏骤停/心肺复苏后全脑缺血再灌注损伤模型的方法简单、重复性好、干扰因素少,能保证各个实验动物脑缺血时间相对一致,减少全脑缺血再灌注损伤的实验误差,有推广应用价值。4.高钾灌注液能够减少大鼠复苏后24小时全脑缺血再灌注损伤,其机制与恢复能量代谢、减轻细胞内钙超有关。
【图文】:
谋;ぷ饔眉捌浠,
本文编号:2695835
【图文】:
谋;ぷ饔眉捌浠,
本文编号:2695835
本文链接:https://www.wllwen.com/linchuangyixuelunwen/2695835.html
最近更新
教材专著