响应型电荷反转聚合物基因输送体系和PDX模型肿瘤EPR效应的研究

发布时间：2020-06-06 02:34

【摘要】：基因治疗能从肿瘤发病根源上着手将治疗基因由载体递送进入肿瘤细胞中,启动杀伤基因或沉默故障基因对肿瘤进行安全有效治疗。阳离子聚合物作为非病毒载体被广泛地应用于基因治疗,然而其远低于病毒载体的转染效率和体内较差的输送效率仍是制约阳离子聚合物转化应用的瓶颈。电荷反转型阳离子聚合物为克服基因输送过程中的生物屏障带来新策略,其包括正电性向电中性/负电性的转换和电中性/负电性向正电性的转换,在基因输送过程中,既可应用于转变纳米复合物稳定性以利于释放核酸药物进而提高基因转染效率,又可应用于体内输送过程中转变纳米复合物的表面特性以利于血液循环、肿瘤渗透和细胞摄取等过程进而提高基因输送效率。本论文为探索解决阳离子聚合物载体在基因输送治疗肿瘤过程中的瓶颈,设计研发了两种具有电荷反转特性的阳离子聚合物:GSH响应型电荷反转聚合物聚丙烯酸乙酯甲苯氧基-2,4-二硝基苯-二乙基氯化铵(poly[(2-acryloyl)etyl(p-methylphenoxy)-2,4-dinitrobenzene)diethylammoniumchloride],MDBP)和酯酶响应型电荷反转聚合物N-[3-((4-辛酸氧基苄基)氧基)-3-丙酰]-N-甲基-聚乙烯铵(N-[3-((4-capryloyl benzyl)oxy)-3-oxopropyl]-N-methyl-quaternized LPEI,L4),两种聚合物能够分别响应肿瘤细胞中的GSH和酯酶实现电荷反转,进而转变纳米复合物表面荷电特性、粒子尺寸特性和稳定性,克服各级生物屏障,以提高基因输送效率和转染效率。本论文第一部分实验研究了具有GSH响应性电荷反转聚合物材料MDBP,其展现对GSH专一性响应特性,极大降低了体内各类小分子生物巯醇的干扰;在N/P为10时,能够稳定压缩包裹DNA形成粒径60～80 nm、电势20～25 mV的纳米复合物;能在GSH条件下触发电荷反转快速释放DNA,具有体外高效的转染效率,在HeLa、A549和HepG2细胞中比同类结构无电荷反转特性的对照载体高出80～1350倍;其以能量依赖的网格蛋白介导和胞膜窖介导途径被细胞摄取内吞。经脂质体包裹后的纳米复合物(Liposome-coating MDBP/DN A,LMDBP)不仅保持GSH响应电荷反转的特性,而且具有良好的血清稳定性;在100%血清中转染效率比PEI/DNA和Lipo2000/DNA高出3～72倍;荷载pTRAIL质粒后,具有较佳的细胞毒性和诱导细胞凋亡率;经尾静脉注射后,其具有良好的长循环和肿瘤富集及渗透特性,对腋下荷瘤裸鼠,显示出优良的抗肿瘤效果。因而验证了该GSH响应型电荷反转聚合物MDBP是一种新型高效的非病毒基因载体。本论文第二部分实验研究了一种具有仿膜融合的酯酶响应型电荷反转聚合物材料L4。通过平行合成方法,引入不同链长的烷基侧链,筛选得到类似病毒膜融合途径将质粒DNA递送进入细胞质而绕过溶酶体困境的L4聚合物,其能压缩荷载DNA成粒径约60nm的纳米复合物,在酯酶条件下发生电荷反转释放DNA,具有较高的转染效率,比PEI/DNA高出约20倍,比同类结构无酯酶响应的对照纳米复合物高出3个数量级;通过共聚焦显微镜和细胞内吞抑制剂验证其能以膜融合途径将DNA直接递送进入细胞质,有利避开了溶酶体困境。在经γPGA包裹后(γPGA-coatingL4/DNA,PL4)纳米复合物依然保持膜融合递送途径,并且在不同血清环境中均能高效转染,具有良好的血清稳定性;荷载pTRAIL质粒后,能有效的抑制肿瘤细胞生长和诱导细胞凋亡;体内腹腔注射治疗荷腹腔瘤裸鼠,PL4/pTRAIL具有较好的抗肿瘤效果,各项指标均优于对照组PEI/pTRAIL,与化疗药物紫杉醇疗效相当,并且毒副作用较低。因此验证了仿膜融合的酯酶响应型电荷反转聚合物L4是一种新型高效的非病毒基因载体。本论文第三部分实验针对目前纳米药物临床转化中存在效果差、失败率高等普遍性问题而引发的对EPR效应质疑,以粒径为30nm、60nm、100nm和200 nm的聚乙二醇-聚苯乙烯(PEG-PS)纳米胶束为工具,对比研究了人源性肿瘤移植模型(Patient-derived Tumor Xenograft,PDX)和细胞系建立的细胞移植肿瘤模型(Cancer Cell Line-derived Xenograft,CDX)的肿瘤 EPR 效应差异,得到了三个关于肿瘤EPR效应结论:1)EPR效应是存在于PDX模型肿瘤,并且纳米胶束在PDX模型和CDX模型中分布趋势相似,粒径越小,肿瘤富集越多,血管渗透越好;2)大粒径纳米胶束(60nm)在CDX模型和PDX模型肿瘤EPR效应是一致的,小粒径纳米胶束(～30 nm)在PDX模型肿瘤的EPR效应能力约为CDX模型肿瘤的60%;3)肿瘤血管壁层中的穿细胞转运途径囊泡-空泡细胞器(Vesiculo-Vacuolar Organelles,VVO)是影响小粒径纳米胶束在CDX模型肿瘤EPR效应高于PDX模型肿瘤的主要原因。该结论有力回应了纳米药物临床转化中研究人员对肿瘤EPR效应的质疑,验证了临床肿瘤中EPR效应的存在,也将为下一代更加高效抗肿瘤纳米药物的设计和临床转化提供重要理论基础和科学依据。
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＇邋＊邋￣邋？＇邋？＞逦■、逡逑图１．３基因治疗临床试验中的案例统计［１２］。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．３邋Ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ邋ａｄｄｒｅｓｓｅｄ邋ｂｙ邋ｇｅｎｅ邋ｔｈｅｒａｐｙ邋ｃｌｉｎｉｃａｌ邋ｔｒｉａｌｓ．逡逑１．２基因递送策略逡逑基因输送技术是将外源性的治疗基因（ＤＮＡ或ＲＮＡ）通过特定方法导入细逡逑胞内或细胞器的过程，是基因治疗中的最为关键研究内容。自１９７２年Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ逡逑Ｔ．和Ｒ．Ｒｏｂｌｉｎ提出基因治疗的概念以来［５］，已陆续发展出三类基因输送技术，逡逑分别是物理输送，，病毒载体和非病毒载体。逡逑物理输送是通过物理手段在细胞膜（或核膜）局部位置制造暂时的孔洞，将逡逑基因从细胞膜外输送到细胞内（或核内），常用的手段包含针孔注射、基因枪、逡逑３逡逑

ｎｅｗ邋ｃａｓｅｓ逦ｄｅａｔｈｓ逡逑图１．２不同地区各类癌症整体的新发病例和死亡比例［１］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．２邋Ｐｉｅ邋Ｃｈａｒｔｓ邋Ｐｒｅｓｅｎｔ邋ｔｈｅ邋Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｃａｓｅｓ邋ａｎｄ邋Ｄｅａｔｈｓ邋ｂｙ邋Ｗｏｒｌｄ邋Ａｒｅａ邋ｉｎ逡逑２０１８．逡逑Ａｄｄｆｅｓｓｅｄ邋ｂｙ邋Ｇｅｎ．邋Ｈｅｒｏｐｙ邋ＣＵｎｋｏｌ邋Ｔｒｉ０！ｓ逦ｖ｜／＇逡逑■悙Ｉ逡逑／Ｃ邋餐逦Ｃｃｒ－逦６＾：逦：？．＇邋ｒ：邋ｃ：逡逑ｆｆ邋Ｖ．ｒｎ0ｇｅｒ：＾逦Ｈ邋＇＇邋ｉｒ－．邋ＩＢ？：逡逑＾邋］＇＇＾ｘＫｃ＜＇邋＾逦＾邋ｆｒ逡逑．？；；；Ｃ

本文编号：2699015