模拟空间环境下低剪切力对肺炎克雷伯氏菌Ⅲ型菌毛表达调控机制的初步研究

发布时间：2020-06-07 12:37

【摘要】：目的:随着我国航天事业的不断发展以及在太空中探索时间的不断延长,航天员感染的风险也逐渐升高,空间微生物学的研究越来越受到国家重视。本研究旨在探索模拟空间环境下低剪切力对肺炎克雷伯氏菌III型菌毛表达的影响及其可能的机制,为空间和地面感染防控研究的靶标筛选提供新的思路和依据。方法:本研究中,以肺炎克雷伯氏菌ATCC BAA-1705菌株M1亚群菌株为研究对象,以0 rpm(静置)、SMG、50 rpm、100 rpm、200 rpm这五种不同且依次增高的剪切力为培养条件,设计了一系列实验,包括甘露糖抑制的酵母凝集试验、透射电镜观察、c-di-GMP提取、RNA提取、逆转录、荧光定量PCR、转录组测序分析、敲除平台的建立等。首先,通过甘露糖抑制的酵母凝集和透射电镜观察不同剪切力对肺炎克雷伯氏菌III型菌毛表达的影响,然后利用肺炎克雷伯氏菌III型菌毛的结构基因和调控基因进行荧光定量PCR和转录组测序分析,对之前的表型实验结果进行验证,最后通过c-di-GMP表达水平的检测、c-di-GMP相关GGDEF基因的转录组测序分析及荧光定量PCR等试验对分子机制进行研究。结果:甘露糖抑制的凝集试验显示,低剪切力的SMG、0 rpm、50 rpm三组凝集量多,而高剪切力的100 rpm、200 rpm两组凝集量相对少,且200 rpm组凝集量最少。凝集效价分析中,取以5为底的对数后,各组凝集效价的平均值分别为6.67、5.67、5.67、4、2.67,数据经ANOVA分析具有统计学意义(P0.05)。通过电镜观察发现,低剪切力SMG、0 rpm、50 rpm条件下培养的肺克,可观察到的III型菌毛多,而高剪切力100 rpm、200 rpm组少。通过qRT-PCR试验及转录组测序结果分析发现,低剪切力的条件下,肺炎克雷伯氏菌III型菌毛结构基因及相应调控基因表达上调,与之前表型试验结果相吻合。第二信使c-di-GMP的检测结果中,SMG、50 rpm、200 rpm组c-di-GMP的平均表达水平分别为27.15ng/m L、56.3 ng/m L和84.1 ng/mL。针对17个c-di-GMP表达相关的GGDEF基因进行转录组测序分析,并与qRT-PCR试验结果相比对,发现了7个差异表达较显著的基因(KPHS-06770、KPHS-17760、KPHS-29590、KPHS-38170、KPHS-39010、KPHS-39950和KPHS-47910)。结论:甘露糖抑制的酵母凝集试验和透射电镜观察两个表型试验均显示,随着剪切力的增高,III型菌毛的表达降低,这提示低剪切力可能促进肺炎克雷伯氏菌III型菌毛的表达。通过qRT-PCR试验及转录组测序结果分析发现,低剪切力的条件下,肺炎克雷伯氏菌III型菌毛结构基因及相应调控基因表达上调,进一步验证了以上发现。之后,针对c-di-GMP相关的GGDEF基因的研究显示,随着剪切力的降低,KPHS-06770、KPHS-17760、KPHS-29590、KPHS-38170、KPHS-39010、KPHS-39950和KPHS-47910这7个基因表达明显升高。因此,我们推测,低剪切力促进肺炎克雷伯氏菌III型菌毛表达的分子机制有可能是以上7个基因中的一个或多个基因表达上调,造成局部的c-di-GMP表达水平增高,从而促进肺炎克雷伯氏菌III型菌毛的表达。以上研究提示,在低剪切力的空间环境下,肺炎克雷伯氏菌III型菌毛的表达增加,可能造成其生物被膜和致病能力改变,从而对航天员的健康构成潜在的威胁。
【图文】：

图 2.1 肺克 M1 亚群菌株在不同剪切力下的生长状况Fig 2.1 The growth conditions of the M1 subgroup strains of Klebsiella pneumoniaunder different shearing forces甘露糖抑制的酵母凝集试验初，本试验分别以对数中期和对数后期的细菌进行甘露糖抑制的酵母凝但是从凝集结果来看，对数后期的凝集量更多，更有利于后续的试验观察后进行的试验均以对数后期培养的菌为研究对象。试验中以对数后期培养的细菌为研究对象，，甘露糖抑制的酵母凝集试验，低剪切力的 SMG、0 rpm、50 rpm 三组凝集量多，而高剪切力的 100 rpm 两组凝集量相对少。200 rpm 组的凝集量比 100 rpm 组少，且在五组中少，如图 2.2 所示。随后，SMG、0 rpm、50 rpm、100 rpm、200 rpm5 倍梯度稀释后分别进行凝集试验，观察各组凝集情况，以观察到凝集的

图 2.2 甘露糖抑制的酵母凝集试验Fig 2.2 The mannose-suppressed yeast-agglutination tests of the M1 subgroup strainsKlebsiella pneumoniae注：图中为 SMG、0 rpm、50 rpm、100 rpm、200 rpm 五种不同剪切力条件下肺炎克 III 型菌毛的酵母凝集试验结果，图中以不同剪切力代表各自的组别。）
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R446.5

【参考文献】

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本文编号：2701429