基于质谱的临床干血斑中化学毒物快速检测新方法研究

发布时间：2020-06-07 14:10

【摘要】：临床化学毒物按照毒性为可分为剧毒、高毒、中毒、低毒和微毒五个等级,其数量庞大,仅剧高毒物质就有5000余种,种类繁多,涉及领域广泛。在我国,每年鼠药、农药、镇静催眠药、植物有毒成分等化学毒物的误服、蓄意投毒所造成的临床中毒事件屡有发生,对公共安全和人身健康造成极大威胁。化学毒物经过呼吸道、消化道及皮肤多种方式侵入机体,具有含量低、毒性高、病情发展快的特点,易造成主要生理功能障碍,引发多器官衰竭甚至死亡。临床化学中毒救治的首要前提是明确何种毒物中毒,以及中毒剂量、途径等,因此,发展快速、准确的临床化学毒物检测技术非常重要。干血斑(Dried Blood Spot,DBS)是一种先进的血液采集及保存方式,仅需将指尖或足跟血滴在滤纸卡上,常温下干燥2小时以上完成制备,具有操作简单、损伤小、便于运输和储存的优势,目前在临床快检方面备受重视,便于与多种分析检测技术,如液相色谱-串级质谱、甚至常压质谱等结合,从而实施临床中毒的快速检测和持续监测。其中,液相色谱-串级质谱技术可针对临床化学毒物检测浓度低、结构相似物繁杂及性质差异大等特点,以其高灵敏度和高选择性,为临床中毒快速诊断和救治提供可靠、快速的定性定量依据。针对干血斑中的临床化学毒物快速检测,如何实现普适、高效的样品提取,便成为方法发展中的决定性要素。另外,近年来备受关注的常压质谱,是一种在敞开式大气压环境中便可实施的直接、快速检测技术,可实现通量式质谱信息采集,以便满足临床多样本快速检测、诊断的需要。其中,低温等离子体(Low Temperature Plasma,LTP)离子化技术的构建较为简单、便捷,其等离子体温度低、且无需喷雾溶剂,利于实现机体的无损分析。LTP质谱和干血斑中的临床化学毒物快检是否能够成功对接?其难点则在于如何增强离子化,以及选择性地从复杂基质中检测出痕量分析物等方面。本研究针对临床干血斑样本,在重点考察滤纸卡种类、润湿步骤、提取溶剂种类基础上,建立了以水润湿、甲醇提取等普适的前处理方法,以霉酚酸作为内标,采用液相色谱-三重四级串联质谱(LC-QqQ-MS/MS)实现了对12种香豆素类和茚二酮类抗凝血杀鼠药的定性定量分析。结果表明,在提取过程中加入适量的水润湿滤纸卡,有助于目标化合物从纤维素链上游离出来并获得较高的提取回收率。DMPK-A、-B、-C和903四种滤纸卡对于抗凝血鼠药的干血斑分析存在差异,以903滤纸卡为基底时,各鼠药的提取率为66~115%,且结果稳定(日内RSD小于15%)。除杀鼠酮线性范围为20~500 ng/mL(R~2=0.9987)外,其它11种鼠药的线性范围为5~500 ng/mL(R~2=0.9988~0.9996);12种鼠药的回收率为61%~105%,基质效应在71%~193%(日内小于15%)。该方法准确、灵敏、快速且操作简便,已成功应用于临床实际中毒样本的检测,满足了临床中毒快检的需求,为抗凝血鼠药中毒的诊断救治提供可靠的新技术方法。在上述研究基础上,针对临床常见毒物秋水仙碱,建立以903滤纸卡为基底,采用水润湿、0.1%甲酸-甲醇提取的快速前处理方法,与液态血浆的处理过程相比,具有操作简单、用时短、提取效率高的优势。以瑞芬太尼为内标,采用LC-QqQ-MS/MS对秋水仙碱定性定量检测。经方法学验证,秋水仙碱的线性范围为2~100 ng/mL(R~2=0.9991),回收率在100~115%,基质效应为108~153%(日内小于15%),各项稳定性考察均符合方法学要求,RSD15%。我们已将该方法成功应用于临床实际中毒样本的检测,包括血浆、尿液、骨髓及透析液废液。结果表明,干血浆斑与液态血浆的检测结果具有较好的一致性,并且秋水仙碱在各生物样本中的浓度与文献报道的分布情况一致,为临床秋水仙碱中毒的诊断提供可靠的新技术方法,指导临床救治工作。为实现临床干血斑样本的直接、实时检测,针对具有精神活性的芬太尼类药物,建立针对基于干血斑的低温等离子体-四级杆-飞行时间质谱(LTP-QTOF/MS)快速分析技术,并对提高离子化效率和纸基底修饰方法进行初步探究。先以咖啡因为模型化合物,分别针对性优化了LTP构建参数,确定的最优条件为,以铜丝作为外加电极,电极间距为3.5 cm,电压在2~2.5 kV,He气流速为0.25 L/min及探针到质谱进样口距离为2 cm。针对5种芬太尼类分析物,通过尖端套管对LTP探针进行结构改造,聚焦等离子体束,可以使芬太尼类化合物的信号增强2~3.5倍;另外,干血斑滤纸基底以含0.1%甲酸-甲醇浸润后可得到较佳的质谱响应,以石墨涂覆辅助激光照射有助于增加基底导电、导热性能,分析物信号提高1.4~2.2倍。分析物在解吸附后进入Q-TOF-MS/MS质谱分析器后,干燥气流速为影响质谱响应的主要因素,毛细管电压为800 V,干燥气流速为8 L/min,喷雾器压力为20 psig时,芬太尼类化合物质谱信号最高。目前5种芬太尼类化合物的LTP-QTOF/MS灵敏度为350 ng/mL,LTP-QTOF-MS/MS灵敏度略有提升,但仍比LC-QTOF MS/MS的灵敏度低1~2个数量级。预计下一步将从高功率激光辅助离子化、尾焰与源间距、尖端尾焰聚焦等多因素优化出发,及掺杂喷雾溶剂等提高离子化效率。
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血浆,折叠式,采集卡,文献

军事科学院硕士学位论文纸卡（岛津公司）则可在无需离心和低温条件下，直接过滤为血浆。Henion 等[8]制备了一种折叠式血浆采集卡，无需离加到滤纸卡的全血溶液中分离出血浆。针对滴加在外层的血两层商品化过滤膜有效去除红细胞，并将血浆浸润至内层滤可获得干血浆斑样品。该滤纸卡便于样本的妥善保存，更易程。与商品化的血浆采集卡相比，其 HCT 适用范围扩大，0%的血液，从而在一定程度上克服了商品化滤纸卡 HCT 适）的问题。

示意图,离子化,文献,示意图

图 1.2 DESI 离子化示意图，引自文献[64]雾电离（PSI）基底的常压离子化技术。喷雾溶剂滴加到滤纸上后通过高电场驱动，一同迁移到达尖端发生电喷雾SI 相比，该技术无需气体作为辅助，喷雾溶剂用量基底，裁剪成三角形，其尖端有助于电喷雾的发分析物在喷雾溶剂与滤纸相互作用下发生色谱分离、喷雾溶剂和质谱参数，滤纸成为影响分析物离数，基于滤纸类型的考察和化学修饰的研究发展迅高疏水性，，将其制备成微球型，通过分散、聚合纸对样品具有富集作用，减少溶液纵向渗透，提的检测信号。
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R595;R446.1

【参考文献】