Cyanine荧光探针合成方法学研究及在硝基还原酶检测中的应用

发布时间：2020-06-15 20:01

【摘要】：目前,荧光成像技术在肿瘤检测、细菌诊断、基因表达、药物作用受体分析、药物筛选及疗效评价等方面在医药领域拥有巨大发展潜力。荧光探针作为荧光成像技术支持的核心之一,开发新型高效的荧光探针能更好的对疾病进行识别诊断,并为新药的研发提供新技术及思路。目前以花菁染料为基础的荧光探针已成为研究热点,因为花菁染料用于生物学检测具有高消光系数,长吸收和发射,高量子产率等优点。在花菁染料中,特别是荧光探针Cyanine 5(Cy5)的衍生物,其吸收和发射峰在近红外光区,可适用于体外和活体实验。目前在其多烯主链上引入功能性基团,主要依赖于关键中间体γ-卤代Cy5的构建,但目前的合成方法路线复杂,反应条件苛刻,副产物多,收率低,严重限制了 Cy5染料功能化的应用。本文发现了一种快速、便捷地合成新方法,用于Y-卤化物(Br,I-)或拟卤化物(SCN-,SeCN-)的Cy5荧光探针的合成,我们首先通过一个简单的离子交换反应使得Cy5(X-)与相应的卤素离子或拟卤素离子进行阴离子交换,然后由于阴离子氧化还原电位的不同,X-可被N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)氧化,形成X-Cl中间体,其可以快速地与Cy5染料发生亲电取代反应生成Y-卤代或拟卤代Cy5荧光探针。通过这个简便地合成方法,我们可以得到多种卤代或拟卤代的产物,拓展了此类卤代中间体的多样性,简化了此类化合物的合成方法。此方法反应条件温和,产物单一,收率较高,为Cy5荧光探针的合成提供了新的高效合成途径。硝基还原酶(nitroreductase,NTR)在药物的激活、肿瘤治疗、抑制剂研发等领域拥有良好的应用前景。通过测定生物体系中的硝基还原酶对进一步了解其生物功能和衡量生物体的状态非常重要。近年来,用于检测硝基还原酶的荧光分子探针已被不断研究开发,并用于细菌以及细胞中硝基还原酶的检测。但对激活型荧光分子探针的研究还很少,因此本文首次基于γ-溴代的Cy5染料设计合成了一系列硝基还原酶激活型荧光分子探针,通过对细菌中硝基还原酶的检测,用于细菌感染的诊断。我们以γ-溴代的Cy5染料为基础,通过Suzuki-Miyaura反应合成了四个能够对硝基还原酶选择性检测的新型智能荧光探针。我们选取荧光激活效果最好的probe 4进行了荧光性质检测,结果显示Cy5的荧光能够被硝基基团淬灭;与硝基还原酶作用后荧光恢复并且有5倍的荧光增强;经过对多种物质的检测证实probe 4与硝基还原酶发生特异识别反应;对细菌及细胞毒性低;且在E.coli和S.aureus中的成像效果显著。说明了新方法的多功能性和简单性。
【学位授予单位】：哈尔滨商业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R446.6
【图文】：

逡逑原酶激活型智能型荧光探针ＮＦＰ和ＮＴＰ，如图１－１０。选择Ｒｅｓｏｒｕｆｍ作为荧光体，是因逡逑为它的７－羟基位被取代后会发生荧光淬灭［８３］。得到的探针ＮＦＰ和ＮＴＰ本身几乎无荧逡逑光，但在ＮＡＤＨ存在下，这两个探针的硝基可被硝基还原酶还原为羟胺或氨基，从而逡逑释放出Ｒｅｓｏｍｆｍ荧光体使荧光显著增强。并且细胞中的其它内源性物质均不能改变探逡逑针的荧光。据此，得到了选择性高、灵敏度高激活型硝基还原酶荧光分子探针ＮＦＰ和逡逑ＮＴＰ，并且已分别成功用于细胞缺氧状态以及大肠杆菌中硝基还原酶的检测研究［８４］。逡逑ＮＦＰ：邋ｒ邋＝邋ｏ逦Ｌ逦＿逡逑ＮＴＰ：邋Ｒ邋＝邋Ｓ逦Ｘ＝Ｈ，邋ＯＨ逡逑—＾ｏ0ａ。逡逑Ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ逡逑图１－１０探针ＮＦＰ和ＮＴＰ对硝基还原酶的响应机理逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１０邋Ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ｏｆ邋ＮＦＰ邋ａｎｄ邋ＮＴＰ邋ｗｉｔｈ邋ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ逡逑Ｔａｎｇ等［８５］利用硝基咪唑与菁染料Ｃｙ７上使Ｃｙ７自身荧光淬灭，并且利用Ｃｙ７具有逡逑近红的外特性，得到近红外酶激活型智能硝基还原酶探针Ｃｙ－Ｎ０２如图１－１１。由于硝基逡逑淬灭了邋Ｃｙ７荧的光效应，所以探针本身表现出低荧光响应；而硝基还原酶对硝基的还原逡逑作使得Ｃｙ７的荧光强度得到恢复。并且探针的激发与发射波长分别为６９５邋ｒｎｎ与７５０逡逑ｎｍ

逦Ｙｉｅｌｄ邋ｕｐ邋ｔｏ邋９０％逡逑Ｃｙ邋５．５：邋Ａｒ＝邋Ｐｈｅｎｙｌ；逡逑图２－１荧光荧光探针Ｃｙａｎｉｎｅ邋５的设计思路逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋Ｄｅｓｉｇｎ邋ｏｆ邋ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋Ｃｙａｎｉｎｅ邋５逡逑此外，利用获得的溴代Ｃｙ５，通过Ｓｕｚｕｋｉ－Ｍｉｙａｕｒａ金属偶联反应合成了四个用于逡逑选择性感测细菌硝基还原酶（ＮＴＲ）活性的新型智能荧光探针（如图２－２），用于细菌逡逑的成像检测，对细菌感染疾病的诊断有重要意义，说明了新方法的多功能性和简单性。逡逑＾邋－邋ｋ邋：ｙ逡逑ＯＨ逦Ｉｈ逡逑Ｃｙ邋５－Ｂｒ逦ｐｒｏｂｅ邋１－４逡逑Ｒ＝邋Ｈ0＾邋0Ｈ邋ｈｏ．ｂ＾＾ｎ0ｊ逡逑ＯＨ逦ＯＨ逡逑ＯＨ逡逑ｐｒｏｂｅ邋１逦ｐｒｏｂｅ邋２逦ｐｒｏｂｅ邋３逦ｐｒｏｂｅ邋４逡逑图２－２邋Ｃｙａｎｉｎｅ硝基还原酶荧光探针的设计思路逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｄｅｓｉｇｎ邋ｏｆ邋ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ邋ｐｒｏｂｅｓ逡逑２．２实验仪器及试剂逡逑２．２．１实验仪器逡逑表２－１实验仪器逡逑Ｔａｂｌｅ邋２－１邋Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ邋ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ逡逑仪器名称逦仪器来源逡

【参考文献】

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本文编号：2714921