Kras在急性移植物抗宿主病中的作用及相关分子机制研究

发布时间：2020-06-20 11:30

【摘要】：研究背景异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是治疗血液系统肿瘤最有效的方法之一,然而急性移植物抗宿主病(aGVHD)的发生作为allo-HSCT后常见而且严重的并发症影响了移植疗效,限制了其使用。aGVHD的发生是由于移植物中供者来源的成熟T细胞识别宿主MHC(主要组织相容性复合体)抗原,增殖分化为效应T细胞,对宿主组织或器官发动免疫攻击,进而导致宿主组织器官受损的一系列病理生理过程。T细胞在aGVHD的发生中发挥了不可替代的重要作用。Ras蛋白由Ras基因编码,为膜结合型的GTP/GDP结合蛋白,TCR被刺激后激活Ras,在成熟T细胞中,Ras活化导致Raf聚集并被激活,进一步通过MEK/ERK信号途径影响淋巴细胞功能。哺乳动物Ras蛋白存在H-ras,N-ras 以及K-ras(K-ras4A,K-ras4B)四种异构体,不同Ras蛋白异构体间功能不完全相同。目前对Kras如何影响淋巴细胞增殖分化发育等研究较少,具体机制尚不清楚。我们前期研究发现Kras缺失对早期T细胞发育没有明显影响,但Kras缺失是否影响成熟CD4+及CD8+T细胞发育分化,以及是否通过影响T细胞分化发育从而影响GVHD的发生发展亦不清楚。本研究将首次探索Kras在aGVHD发生发展中的作用及相关分子机制。研究方法1、建立Kras敲除型(VavCreKrasfl/fl)小鼠模型:Kras基因的第一个外显子两端被安插了 LoxP位点,将携带Krasfl/fl基因的小鼠与携带VavCre转基因小鼠进行交配,从而得到整个造血系统Kras基因第一个外显子缺失的小鼠。2、建立小鼠aGVHD模型:给予受体小鼠BALB/c 900rads照射剂量,将来源于供体小鼠T细胞,以及取自Rag1-/-小鼠骨髓细胞一起通过尾静脉注射进受体小鼠体内,每两天观察小鼠生存情况及表现,持续观察60天,统计生存率及GVHD评分。3、荷瘤小鼠模型(GVL):给予经致死剂量辐照的BALB/c小鼠接种带有荧光素酶(luciferase)的A20细胞(A20-luc),同一天荷瘤小鼠接受上述骨髓细胞移植,实时监测荷瘤小鼠生存情况。4、采用混合淋巴细胞培养、流式细胞术、Western Blot、RNA测序等方法检测T细胞增殖、活化、细胞因子分泌,以及抗-CD3刺激下Ras下游信号通路的活化情况。研究结果1、在MHC-错配小鼠模型中,供者T细胞Kras缺失可以减弱aGVHD的发生及严重程度,但不影响GVL。2、混合淋巴细胞反应中,Kras缺失导致T细胞增殖能力下降。3、在aGVHD小鼠模型中,T细胞活化水平未受明显影响,然而T细胞分泌的促炎症细胞因子减少。4、在aGVHD小鼠模型中,Kras缺失的CD4+T细胞经抗-CD3抗体刺激后,Ras/Raf/MEK/ERK信号通路活性降低。研究结论在aGVHD小鼠模型中,T细胞Kras缺失通过减弱T细胞增殖能力,影响促炎症细胞细胞分泌及减弱TCR相关信号通路活性抑制急性移植物抗宿主病发生,但并不影响移植物抗肿瘤效应。本研究为临床发现新的治疗靶点以及开发新的靶向药物提供了依据。
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R457.7
【图文】：

图２．邋Ｒａｓ的活化与失活逡逑Ｒａｓ是ＴＣＲ信号途径中的重要信号分子。Ｒａｓ蛋白由Ｒａｓ基因编码，型的ＧＴＰ／ＧＤＰ结合蛋白，定位于细胞膜内侧，属于三磷酸鸟苷（ＧＴＰ白，通过ＧＴＰ与二磷酸鸟苷（ＧＤＰ）的相互转化来调节信息的传递，在生长分化信号方面起重要作用。鸟苷酸交换因子（ＧＥＦｓ）通过促进ＧＴＰ从而活化ｒａｓ，而ＧＴＰ酶活化蛋白则通过催化ＧＴＰ水解为ＧＤＰ使Ｒａｓ。与ＧＴＰ结合的Ｒａｓ特异性活化丝氨酸／苏氨酸激酶Ｒａｆ，Ｒａｆ磷酸化Ｋ１／２，进一步磷酸化并激活丝氨酸／苏氨酸激酶ＥＲＫ１／２，最终导致转－１上调，并促进其之后的活化。已有研宄表明ＴＣＲ及ＢＣＲ被刺激后激胸腺细胞及Ｂ细胞增殖发育及细胞因子产生中发挥重要作用，在成熟Ｔｓ活化导致Ｒａｆ聚集并被激活，进一步通过ＭＥＫ／ＥＲＫ信号途径影响淋能［２４］。（图邋３－１、３－２）。逡逑

图３－１．邋ＴＣＲ信号转导通路模式图逡逑

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本文编号：2722351