应用环介导等温扩增技术检测幽门螺旋杆菌并分型的研究

发布时间：2020-06-22 11:16

【摘要】：幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori,Hp)感染作为消化内科常见的感染细菌,在全球范围内感染率一直较高,可导致胃炎、胃溃疡、胃癌等疾病。研究发现HpⅠ型的毒性更强,对胃粘膜的损害更大,而HpⅡ型及中间型对胃粘膜损伤较小。准确高效的检测和进行基因分型对Hp的诊断具有较大意义。临床常用的Hp检测方法是碳-14呼气试验,但需要昂贵的设备,在基层医疗单位难以开展。基因分型检测比较复杂,并未普及。尽管荧光定量PCR作为常见的核酸检测技术在国内外中、大型医院普遍开展,但是,荧光定量PCR反应仪器比较昂贵,对操作人员能力素质要求比较高,对环境的要求同样比较严格,也不适合在基层医院以及野外推广普及。近几年发明的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),操作简单,特异性强,灵敏性高,结果稳定可靠。通过加入钙黄绿素或羟基萘酚蓝等颜色指示剂,实验结果用肉眼即可分辨。LAMP扩增速度快,效率高,适合在基层医院以及医疗条件贫乏的地区进行检测。本研究针对Hp保守区域设计引物,建立LAMP技术检测Hp并对其进行基因分型。第一部分应用环介导等温扩增技术检测幽门螺旋杆菌的研究目的:建立快速、简单、高效检测Hp的LAMP方法。方法:通过NCBI网站,下载Hp 16S r RNA的全部序列,使用Clusaw X软件进行多重序列对比,选出保守区段,利用LAMP引物软件Primer Eplorer V5设计LAMP引物。收集有上腹不适或有恶心、反酸、呕吐等胃病临床症状的患者唾液及粪便标本152例,其中包括唾液标本76例,粪便标本76例。以及经检测确定为健康人群的唾液及粪便标本24例,其中包括唾液标本12例,粪便标本12例。唾液标本和粪便标本相对应,均收集于同一患者。即胃病患者76人,健康人群12人。胃病患者均做碳-14呼气试验。唾液按照一管式通用样本DNA提取试剂盒法提取标本DNA,粪便标本用粪便基因组DNA提取试剂盒提取标本DNA。以荧光定量PCR反应对细菌进行定量。进行LAMP反应条件的优化,通过对非特异模板进行扩增来验证特异性;通过扩增倍比稀释后的样本来验证灵敏性。同时,对实验结果进行电泳,比较电泳结果和添加颜色指示剂后结果是否一致。结果:经过多次实验,探索LAMP合适的反应条件。LAMP对非特异模板进行性扩增,未出现阳性结果。通过添加颜色指示剂钙黄绿素或羟基萘酚蓝,反应产物用肉眼观察,得出结果和通过凝胶电泳得出的结果相同。添加颜色指示剂后无需开盖操作,直接用肉眼读取结果,避免了气溶胶污染。LAMP对76例粪便标本检测,检测到阳性53例,检测阳性率为69.7%。LAMP对76例唾液标本进行检测,检测到阳性43例,检测阳性率56.6%。76例患者进行碳-14呼气试验检测,检测到阳性51例,阳性率67.1%。荧光定量PCR对76例粪便标本进行检测,检测到阳性47例,阳性率61.8%。荧光定量PCR对76例唾液标本进行检测,检测到阳性37例,阳性率48.7%。对24例阴性标本进行检测,LAMP无特异性扩增,特异性较好。通过对倍比稀释的模板进行扩增,LAMP比荧光定量PCR灵敏性高10倍。结论:本实验针对Hp的16S r RNA区域基因设计了特异性引物。通过对实验条件的优化,保证了特异性和灵敏性,提高了反应效率。建立了检测Hp的可视化LAMP技术,其特异性及灵敏性均较好,适合在基层医院以及设备缺乏的地区推广。第二部分应用环介导等温扩增技术对幽门螺旋杆菌分型的研究目的:建立对HpⅠ型和Ⅱ型基因型分型的可视化LAMP技术。方法:收集有上腹不适或恶心、呕吐等胃病临床症状的患者粪便标本76例,经检测健康人群粪便标本12份。通过NCBI网站,下载Hp菌株Cag A基因和Vac A基因的全部序列,使用Clusaw X软件进行多重序列对比,利用LAMP引物软件Primer Eplorer V5设计LAMP引物。通过对非特异性模板进行扩增来验证引物的特异性。对实验结果进行电泳分析,和添加颜色指示剂的实验产物进行对比,看结果是否一致。同时用PCR对粪便标本进行分型。应用SPSS 21.0软件对LAMP和PCR两种检测方法比较是否有统计学差异以及一致性是否良好。结果:LAMP引物特异性较好,对非特异性模板无扩增,专一识别Hp菌株Cag A基因和Vac A基因分型相关基因多态区。对实验结果进行电泳分析,得出的结果和添加颜色指示剂后肉眼观察到的实验结果无差异。第一部分LAMP对76例粪便标本检测到53例阳性,荧光定量PCR检测到47例阳性,选择两种方法检测均阳性标本47例,LAMP和PCR分别对其进行分型检测。LAMP检测出HpⅠ型35例,阳性率为74.5%,检测出HpⅡ型7例,阳性率为14.9%,中间型5例,阳性率10.6%。PCR反应检测出HpⅠ型31例,阳性率为66.0%,检测出HpⅡ型9例,阳性率为19.1%,中间型检测出7例,阳性率14.9%。应用SPSS21.0软件对LAMP和PCR两种检测方法进行比较,可以得出两种检测方法差异无统计学意义。结论:本实验针对Hp的Cag A基因和Vac A基因分型相关基因多态区分别设计了特异性引物。建立了能对Hp进行分型检测的LAMP技术,通过简便的方法,为Hp感染者的治疗提供依据。
【学位授予单位】：承德医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R573;R440

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