肌营养不良基因诊断及新突变致病性研究

发布时间：2020-06-22 17:04

【摘要】：第一部分Duchenne/Becker型肌营养不良基因诊断及突变谱分析目的本研究通过对疑诊肌营养不良的患儿进行临床资料收集并进行基因检测分析,旨在为DMD/BMD患儿明确基因诊断,总结广西地区DMD基因的突变谱,建立经济、快捷的基因诊断策略,探讨DMD基因型与临床表型之间的关系。方法1.收集疑诊肌营养不良患儿的临床资料及生化检测结果。2.所有患儿首先进行MLPA检测DMD基因的全部外显子,检出大片段缺失和重复的患者诊断为DMD/BMD;对MLPA结果阴性者,再用肌病panel二代测序检测包括DMD基因在内众多的相关基因的外显子和邻近内含子区域,进行诊断及鉴别诊断。3.根据MLPA结果绘制柱状图总结缺失和重复突变的热点和断裂点热点。在PUBMED、CNKI数据库中检索其他地区人群DMD基因大片段突变的信息,并将其与本研究结果相比较。4.对MLPA结果在Leiden数据可进行阅读框架检查并分析基因型与临床表型之间的关系。5.对二代测序筛查出的致病位点检索Leiden数据库,明确这些突变确是否为首次发现,并应用SIFT、Poly Phen、Mutationtaster预测突变对蛋白质功能影响。结果1.共纳入198例肌营养不良患儿,确诊DMD/BMD175例,其他类型肌营养不良患儿12例,其中肢带型肌营养不良8例,Bethlem肌病3例,糖原累积症1例,11例患儿未能从基因水平确诊;187例(94.4%)患儿经DMD基因MLPA及肌病panel二代测序检测明确了基因诊断。DMD患儿临床表现有不同程度的肌无力,血CK值均有不同程度增高,最高为57088U/L,最低为173U/L。2.1 132例患儿DMD基因MLPA检测出大片段突变,其中113名患者为缺失突变,19名患者为重复突变,共发现了77种不同的突变,24例为单个外显子缺失,89例为多个外显子缺失,其中最大的缺失片段为1-60号外显子。2.2缺失突变主要集中在45-55号外显子,其次是在3-17号外显子;重复突变则主要集中在DMD基因的3‘端。3.DMD基因大片段突变的断裂点分布存在热区43-55号内含子,以44号内含子最常见(13.1%);缺失突变的断裂点主要分布在43-55号内含子,其次为7号内含子,其中44-54号内含子为最常涉及的起始断裂点,以44号内含子最常见,43-55号内含子为最常涉及的结束断裂点,以52、54号内含子最常见;重复突变的断裂点分布无明显热区。4.在132例缺失和重复突变中,26例患儿(19.7%)为整码突变,106例(80.3%)为移码突变,4个患儿因年龄太小无法判断表型为DMD或者BMD,111例DMD/BMD患者与框架学说相一致,符合率为86.7%。5.43例DMD患儿为DMD基因点突变,包括无义突变23例、错义突变1例、剪接突变11例和移码突变8例,其中24例为未报道过的新突变,生物学软件均预测为致病性突变。结论1.疑诊肌营养不良的患儿中以DMD/BMD为主。2.对临床疑诊肌营养不良的患儿先进行MLPA检测DMD基因外显子,结果阴性者再进行肌病panel二代测序,该策略能有效,简便的为DMD/BMD病人明确基因诊断。3.广西人群DMD基因的突变类型多样,以大片段缺失突变为主,其次为点突变。4.缺失突变热点及缺失断裂点热区和既往的报道是一致的;重复突变主要分布在3‘端,和既往研究报道不相符,重复突变的断裂点分布无明显热区,亦和其他研究数据不同。5.82%的DMD/BMD患者与框架学说相一致,突变是否符合框架学说对判断患儿的病情有一定的帮助。6.DMD基因点突变的类型及构成比和既往研究一致。第二部分新剪接突变致Bethlem肌病一家系的临床、病理及发病机理研究目的本研究通过对一个疑诊Bethlem肌病家系的患者的临床表现、影像学、病理活检、致病基因检测等的研究,经检索数据库判断其致病性,进而用生物学信息学软件预测新突变对m RNA剪接的影响,最后用实验方法从m RNA和蛋白质水平证实新突变的致病性及探索其发病机制,为精准遗传咨询乃至基因治疗提供理论依据。方法1.收集一个Bethlem肌病家系的临床表现、辅助检查、肌活检病理以及影像学资料,绘制遗传家系图。2.结合临床特点进行肌病panel二代测序。3.1对可疑致病位点应用sanger测序对先证者以及家系成员验证,分析是否存在家系共分离。3.2检索相关致病突变数据库,包括Human Gene Mutation Database at the Institute of Medical Genetics in Cardiff、UMD-DMD database和the Leiden Open Variation Database等,明确突变确是否为新突变。3.3在NCBI db SNP数据库、Hap Map数据库、Genome l000数据库和中国人群SNP数据库检索这些突变在正常人群中的出现率。4.应用生物信息学软件预测突变对m RNA及蛋白质功能的影响,以及可能的致病机理。5.设计实验验证生物信息学的理论推测,活检取病人皮肤行原代成纤维细胞培养,用波形蛋白免疫组化鉴定成纤维细胞。6.用皮肤RNA行转录组测序了解突变对m RNA剪接的影响。7.用成纤维细胞c DNA行RT-PCR验证异常剪接的存在,sanger测序明确异常剪接变体的序列。8.对转录组测序的数据进行差异基因表达分析比较患儿及正常对照COL6A2基因m RNA表达量的差异。9.用病人及正常对照三种组织(成纤维细胞、皮肤、肌肉)c DNA行real-time PCR,验证患儿及正常对照COL6A2基因m RNA表达量的差异。10.通过对骨骼肌、成纤维细胞行CollagenⅥ蛋白免疫组织化学染色分析了解病人CollagenⅥ蛋白的表达。结果1.1该家系有三名患者,临床特点为进行性加重的肌无力,不能跑跳,上下楼梯困难,踮脚尖走路,肘关节、髋关节挛缩,双手合十不能,CK值最低为576U/L,最高危759U/L。三个患者病情轻重不一,以父亲症状最为严重,症状最轻为次子。1.2双下肢骨骼肌核磁共振表现特点为两侧下肢对称性弥漫性脂肪浸润,脂肪及结缔组织含量增多,正常肌肉组织减少,大腿肌群损害重于小腿。1.3骨骼肌病理HE染色示肌纤维直径大小不一,肌纤维变性、坏死,结缔组织增生,符合肌营养不良改变。2.肌病pannel二代测序发现三个患者均在COL6A2基因上存在杂合剪接突变c.736-1GC。3.1对家系成员行sanger测序验证发现为新生突变,而且该突变存在家系共分离。3.2该突变在1000 Genomes,db SNP,Ex AC等数据中均显示在正常人群中突变发生频率极低,不属于多态性改变。3.3相关致病突变数据库无该突变的相关记录及报道,为未报道过的新突变。3.4该突变位于剪接区的高度保守区域,Mutation Taster预测结果为致病性突变。4.Human Splicer Finder和Alternative Splice Site Predictor软件对该剪接位点突变预测的结果均提示突变对m RNA剪接有着决定性的作用,可能会导致三种结果:内含子保留,替代性的受体位点或者突变临近的外显子跳跃。5.皮肤原代成纤维细胞呈梭形和不规则三角形,胞体狭长、透亮,胞浆丰富,波形蛋白免疫组化示波形蛋白在胞浆呈棕色颗粒状表达。6.转录组测序结果发现该病人皮肤c DNA存在正常m RNA,占50%,还有两种异常剪接变体,一种为部分4号内含子保留,占36%,另一种为5号外显子跳跃,占14%。7.针对两种异常剪接变体行RT-PCR,提示病人c DNA存在异常剪接序列,expasy软件预测异常剪接后的序列可产生截短的蛋白质。8.转录组测序的数据差异基因表达分析提示病人m RNA中COL6A2基因的表达量仅为正常对照的1/100。9.病人三种组织(成纤维细胞、皮肤、肌肉)c DNA行real-time PCR示COL6A2基因在病人的三种组织中表达均比正常人少,最少的为成纤维细胞,表达量仅为正常对照的1/10。10.CollagenⅥ蛋白的免疫组化示CollagenⅥ蛋白在骨骼肌表达量无明显减少、分布部位正常,而成纤维细胞CollagenⅥ蛋白则表达缺失。结论1.三个患者的临床表现符合Bethlem肌病,遗传方式为常染色体显性遗传,病情随年龄增加而逐渐加重。2.报道了COL6A2基因剪接突变c.736-1GC为Bethlem肌病的致病性突变。3.剪接位点突变c.736-1GC的致病机理为突变导致替代性的受体位点激活和突变临近的外显子跳跃,形成异常剪接变体,进而形成截短的蛋白质。4.双下肢MRI检查对于BM的诊断及选择合适的骨骼肌活检部位具有重要帮助,同时还可以了解受累肌群的分布及判断严重程度,而病变肌肉中脂肪比例的多少也可以作为判断BM病情的一项指标。5.在Bethlem病人中,肌肉组织的CollagenⅥ蛋白免疫组化结果可能和皮肤成纤维细胞的结果不一致,临床医生需结合病人的临床表现及基因检测结果综合分析。6.在研究剪接位点突变对m RNA剪接的影响时,转录组测序是一个很好的方法,该方法简单、有效,同时还能确定异常剪接变体的比例。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R746.2;R440
【图文】：

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DMD/BMD病人基因诊断分析流程图

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目标区域捕获流程图

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