肠道产NDM型碳青霉烯酶大肠埃希菌的分子特征、传播机制与基因环境研究

发布时间：2020-07-12 08:30

【摘要】：背景与目的大肠埃希菌是人和动物肠道中常见的细菌,为正常菌群的一部分,于1885年首次在健康婴儿的粪便样本中被发现。在机体抵抗力下降,或者肠道粘膜损伤时,大肠埃希菌可突破肠道黏膜屏障入血造成血流感染,还可异位造成尿路、呼吸道等诸多感染。大肠埃希菌是引起医院感染最常见的细菌之一。碳青霉烯类抗生素是当前临床治疗多重耐药革兰阴性杆菌所致感染的重要手段,然而,近年来,随着抗生素的广泛使用,在中国多个地区出现了越来越多的耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE),临床治疗受到严重的威胁。产NDM型碳青霉烯酶是CRE菌株耐碳青霉烯类药物的主要机制之一。研究表明,CRE菌株可呈多重耐药甚至泛耐药性。bla_(NDM)基因可定位于染色体和质粒上,其基因环境中的IS26元件可介导bla_(NDM)基因在不同类型的质粒间水平转移且转移性质粒可介导耐药性在多种肠杆菌科细菌之间传播,最终导致CRE分离率与流行率的显著增加。肠道定植CRE菌是医院环境中碳青霉烯类耐药基因扩散的重要来源。目前,研究人员相继在中国不同地区的粪便样本中检出了产NDM型碳青霉烯酶的大肠埃希菌,同时发现了bla_(NDM-5)和mcr-1基因共存的的泛耐药大肠埃希菌。基于多粘菌素常被用作治疗CRE菌株所致感染的最后一道屏障,产NDM型碳青霉烯酶大肠埃希菌中mcr-1基因的存在与播散导致临床针对此类菌株所致感染治疗效果不佳,患者死亡率较高,已引起人们的广泛关注。目前,国内外对于肠道产NDM型碳青霉烯酶大肠埃希菌流行病学特征报道不多,菌株分子特征、耐药性传播机制及耐药基因的基因环境尚不明确。故此,本研究收集浙江大学附属第一医院患者的1115份非重复粪便样本,从中筛选出肠道产NDM型碳青霉烯酶大肠埃希菌。通过脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)和二代、三代全基因组测序获得的多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)结果研究其同源性;通过体外药敏试验,明确其耐药表征;通过ResFinder查找其耐药基因;通过S1酶切PFGE、Southern印迹杂交、基于PCR的质粒分型实验(PCR-based replicon typing,PBRT)、Plasmidfinder、Blast、质粒接合实验和接合子的体外药敏试验明确耐药性传播机制;通过RAST和Easyfig呈现耐药基因的基因环境,旨在为临床治疗产NDM型碳青霉烯酶大肠埃希菌所致感染和控制bla_(NDM)基因和mcr-1基因的扩散提供科学的依据。方法1.通过含2μg/ml美罗培南的MAC选择培养基从收集自浙江大学附属第一医院患者的1115份非重复粪便样本中初步筛选出CRE菌株,并采用MALDI-TOF MS鉴定和PCR扩增技术进行菌种、常见碳青霉烯类耐药基因(bla_(NDM)、bla_(KPC)、bla_(IMP)、bla_(VIM)和bla_(OXA-48))和多粘菌素耐药基因(mcr-1)的鉴定,最后通过16s rRNA检测技术、PCR扩增及基因测序分析技术,完成本实验24株肠道产NDM型碳青霉烯酶大肠埃希菌的确认。2.通过PFGE初步分析菌株同源性,剔除重复菌株后,采用二代和三代测序技术对菌株进行全基因组测序,通过MLST软件检测菌株中存在的ST分型,最后将PFGE和MLST结果结合综合分析菌株同源性。3.采用琼脂稀释法和肉汤微量稀释法体外药敏试验确定菌株的耐药表征。4.采用ResFinder软件对菌株全基因组信息进行分析,查找菌株中存在的耐药基因。5.通过S1酶切PFGE、Southern印迹杂交、PBRT、Plasmidfinder、Blast、质粒接合实验和接合子体外药敏试验探究菌株的耐药基因定位、质粒特征及菌间传播机制。6.采用RAST软件对菌株基因组数据进行注释,并利用Easyfig软件构建基因环境模式图,呈现耐药基因的基因环境。结果1.2016年1月至2018年6月期间本研究于1115份非重复粪便样本中共鉴定出24株产NDM型碳青霉烯酶大肠埃希菌,其中17株携带bla_(NDM-5),4株携带bla_(NDM-1),2株携带bla_(NDM-13),1株携带bla_(NDM-9)。9株产NDM型碳青霉烯酶大肠埃希菌同时携带mcr-1基因。2.PFGE结果显示本院25株肠道产NDM型碳青霉烯酶大肠埃希菌有18种不同的克隆型别(包括本院首次发现并报道的肠道产NDM型碳青霉烯酶大肠埃希菌L159),其中L704和L724,L935和L938均分别从同一患者中分离,且分别具有相同的克隆型别,故在接下来的研究中剔除了L724和L938,共22株分离菌纳入研究。MLST结果显示,在22株分离菌和L159中共观察到13种不同的ST分型,其中ST167是主要的型别。3.22株菌株均对阿莫西林-克拉维酸、哌拉西林-他唑巴坦、头孢噻肟、头孢他啶、头孢匹罗、头孢吡肟、美罗培南、亚胺培南、厄他培南和左氧氟沙星中介或耐药,其中8株菌株显示对多粘菌素耐药。4.22株菌株均携带多种耐药基因,包括碳青霉烯类、β内酰胺类、多粘菌素、大环内酯类、喹诺酮、替加环素、磷霉素、磺胺类、氨基糖苷类、酰胺醇类、甲氧苄啶和利福平,并在L704,L743,L889,L906,L930,L932和L935中检测到赋予对多粘菌素抗性的mcr-1基因。5.bla_(NDM)基因位于6种质粒复制类型,不同分子大小(~40kb至~300kb)的自转移质粒上,其中,~40 kb的IncX3是主要的类型。bla_(NDM)基因周围的基因环境共有13种类型,bla_(NDM)-ble_(MBL)-trpF-dsbC是其保守结构。6.mcr-1基因位于~60kb的IncI2质粒上,基因环境一致,均为topB-hha-pap2-mcr-1-nikB-nikA-traL。结论1.肠道产NDM型碳青霉烯酶大肠埃希菌多呈多重耐药,甚至泛耐药性,临床应加强对此类菌株的监控。2.分离菌ST型别和bla_(NDM)基因定位质粒类型呈高度多样性;ST167的克隆传播与IncX3质粒的自转移是促进本院bla_(NDM)基因播散的关键因素;bla_(NDM)基因环境多样化,bla_(NDM)-ble_(MBL)-trpF-dsbC是其保守结构。3.IncI2质粒的自转移可介导本院mcr-1基因的菌间传播,且以topB-hha-pap2-mcr-1-nikB-nikA-traL的形式进行菌间转移。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R446.5
【图文】：

2 结果2.1 肠道产 NDM 型碳青霉烯酶大肠埃希菌的检出本研究初步筛选出 460 株 CRE，包括 29 株大肠埃希菌，407 株肺炎菌和 24 株其他的肠杆菌科细菌。29 株耐碳青霉烯类药物的大肠埃希菌的因筛查结果显示，24 株菌株携带 blaNDM，2 株携带 blaKPC，剩余 3 株对 bblaKPC、blaIMP、blaVIM和blaOXA-48的电泳结果均为阴性。最终本研究经过16和 blaNDM的 PCR 扩增检测和测序，共确认鉴定出 24 株产 NDM 型碳青大肠埃希菌，其中 17 株携带 blaNDM-5，4 株携带 blaNDM-1，2 株携带 blaND株携带 blaNDM-9。9 株产 NDM 型碳青霉烯酶大肠埃希菌同时携带 mcr-1 结果见图 2-1、2-2、2-3 与表 2-1。

图 2-2 9 株产 NDM 型碳青霉烯酶大肠埃希菌的 mcr-1 基因电泳图Figure 2-2 Electrophoresis map of mcr-1 gene of 9 NDM- producing E. coli isolates注：M 为标准品 Marker,具体分子量大小见图 2-1; P 为阳性对照；N 为阴性对照

图 2-2 9 株产 NDM 型碳青霉烯酶大肠埃希菌的 mcr-1 基因电泳图igure 2-2 Electrophoresis map of mcr-1 gene of 9 NDM- producing E. coli isolates注：M 为标准品 Marker,具体分子量大小见图 2-1; P 为阳性对照；N 为阴性对

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本文编号：2751695