一种低成本、快速诊断人类登革热病毒感染的肽化学发光酶免疫分析法（CLEIA）的建立

发布时间：2020-07-15 09:07

【摘要】：登革病毒(DENV)是一种在全球广泛传播的蚊媒传染病毒,主要由埃及伊蚊和白纹伊蚊传播,可引起登革热、登革出血热和登革休克综合征,对人类的健康有着巨大的威胁。目前,还没有可用的DENV疫苗和治疗DENV感染的特异性药物,及时、准确的诊断对DENV感染的治疗至关重要。目前临床上检测DENV感染使用较多的方法是PCR法和血清法。PCR法虽然具有高灵敏度和高特异性的优点,但对实验条件要求较高、随感染时间的推移检出率下降快;而血清法不仅具有较高的灵敏度和特异性,还具有操作简便、可检测的时间段长、对实验条件要求较低的优点,所以临床应用更为普遍。不过,由于目前的血清法普遍采用造价较高的DENV重组蛋白作为包被抗原检测血清中的抗体,导致检测成本较高,限制了其在经济条件较差地域的使用。因此,本研究尝试建立一种能低成本、快速、准确诊断DENV感染的方法。DENV主要由3种结构蛋白(核蛋白、膜蛋白和包膜蛋白)和7种非结构蛋白构成,其中,包膜蛋白含有DENV特异性和可诱导机体产生保护性中和抗体的抗原表位。因此,DENV包膜蛋白中的特异性抗原表位的筛选和发现,对减少DENV感染诊断中的假阳性和疫苗的研发都至关重要。为了筛选包膜蛋白上的特异性抗原表位,本研究利用生物信息学方法,对DENV包膜蛋白氨基酸序列的表面可及性、亲水性、抗原性、可塑性和二级结构参数进行了分析,并依据这些分析结果筛选出了 10条潜在的特异性多肽,即E1-E10。随后从这10条多肽中筛选出了 2条特异性和灵敏度相对较好的多肽,即E1和E7,用以建立CLEIA法。为了让2条多肽呈现最好的灵敏度和特异性,本实验对CLEIA法的实验条件进行了优化,优化后的实验条件是:包被抗原的浓度为10μg/mL,放于4。C冰箱过夜;血清的稀释度是1/400,37℃下温育30min;酶标二抗的稀释度是1/160000,37℃下温育 30min。为了确定CLEIA法的cut-off值、灵敏度和特异性,本实验共收集了 176例临床标本,其中120例标本显示anti-DENV-IgM阳性、56例标本显示anti-DENV-IgM阴性。56例anti-DENV-IgM阴性标本中,包括了 10例自身免疫性疾病患者和5例疟疾患者的血清。利用本研究建立的CLEIA法对这些血清标本进行检测,结果显示当采用E1作为CLEIA法的包被抗原时,灵敏度和特异性分别是82.5%和94.6%;当采用E7作为CLEIA法的包被抗原时,灵敏度和特异性分别是79.2%和92.9%;当将E1和E7混合后作为包被抗原时,灵敏度和特异性分别是85.0%和96.4%。实验结果表明,利用多肽E1和E7作为包被抗原建立的CLEIA法具有较好的灵敏度和特异性,可以较好地把DENV感染与疟疾感染、自身免疫病区分开来。结合多肽低价、稳定、易于大规模生产的优势,以及CLEIA法高灵敏度的特点,该方法在诊断DENV感染上具有良好的应用前景。此外,本研究结果对DENV疫苗的研发也具有一定的参考意义。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R446.6;R512.8
【图文】：

氨基酸序列,包膜蛋白,表位,抗原性

３．１邋ＤＥＮＶ包膜蛋白抗原表位的预测逡逑通过邋ＤＮＡＳｔａｒ邋（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ），本实验分析了邋ＤＥＮＶ邋包膜蛋白逡逑的氨基酸序列。本实验主要是通过分析ＤＥＮＶ包膜蛋白氨基酸序列的Ｅｍｉｎｉ的逡逑表面可及性，Ｋｙｔｅ－Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ的亲水性，Ｊａｍｅｓｏｎ－Ｗｏｌｆ的抗原指数，二级结构和逡逑Ｋａｒｐｌｕｓ－Ｓｃｈｕｌｚ的可塑性这５个参数。其中，亲水性和表面可及性是最主要的参逡逑考参数。通过综合分析这些参数，本实验选择并合成出了邋１２条ＤＥＮＶ包膜蛋逡逑白的多肽抗原区域片段，即抗原多肽Ｅ１－Ｅ１０。其中，Ｅｌ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４位于逡逑ＤＩ邋（由Ｅ１？５１位氨基酸、Ｅ１３２？１９０位氨基酸和Ｅ２７８？２９３位氨基酸组成）；逡逑Ｅ５、Ｅ６位于ＤＩＩ邋（由Ｅ５２？１３１位氨基酸和Ｅ１９１？２７７位氨基酸）组成；Ｅ７、Ｅ８、逡逑Ｅ９、Ｅ１０位于Ｄｉｌｌ（由Ｅ２９４？３９２位氨基酸）。这１０条抗原多肽在包膜蛋白所处逡逑的位置和氨基酸序列如下所示。逡逑

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