循环血microRNA-10a,-210和-563作为OPLL特异性诊断标志物的研究

发布时间：2020-07-15 18:38

【摘要】：研究背景与目的颈椎后纵韧带骨化(Ossification of posterior longitudinal ligament,OPLL)是指颈椎椎体后方因退变或应力刺激等原因,导致后纵韧带异位骨化,进而压迫椎管内颈髓,出现神经功能障碍的一种疾病,神经功能障碍可表现为四肢感觉、运动异常,伴或不伴随肌肉萎缩,严重者可因突发的外力而出现四肢瘫痪、大小便失禁,严重危害人类健康。OPLL发病具有种群、地域特异性,流行病学调查研究表明该疾病在日本、中国等国家发病率居高,最早由日本人报道,因此该病又称为“日本病”。文献报道该病与内分泌激素、机械应力刺激及遗传因素等多种机制相关,单一因素无法解释颈椎后纵韧带骨化症的发病机制。学者认为基因调控与后纵韧带骨化发生密切相关,因此探索OPLL特异性基因改变并探索其发病机制尤为重要。除此之外,颈椎后纵韧带骨化起病隐匿,无早期特异性症状,缺乏行之有效的早期筛查、诊断方法。OPLL诊断金标准为颈椎CT,该项检查具有预约时间长,辐射剂量大,价格昂贵等缺点。CT检查操作相对简单,扫描速度快,CT薄层扫描可以重建器官、病灶三维影像,方便临床诊断和治疗,大大提高患者生存率,预后改善明显。由于以上优势,自21世纪至今CT检查的普及率越来越高,尤其在我国基层医院使用频率逐年增加。当人们享受这一便利时,被检查者接受的辐射剂量也随之增多,增加了致癌的风险。因此如何进行早期、快速、精准、无创的诊断成为目前OPLL又一亟待解决的问题。目前较多文献报道后纵韧带异位骨化与成骨相关基因表达密切相关,其表达受到上游调控因子的调节,提示与OPLL的发生、发展有重要联系。在众多调节机制中,microRNA(miRNA)起到了至关重要的作用。miRNA是一类进化上高度保守的小分子非编码RNA,主要在转录后调控基因表达,长度在18-22nt之间,人体内miRNA调控超过三分之一以上的基因表达,调控多种生理病理过程,比如生长发育、免疫应答、肿瘤发生等。在肿瘤发生等领域,有大量实验分析肿瘤组织及该器官正常组织的miRNA,表明某些特异性miRNA表达的上调或下调与肿瘤发生密切相关。这一现象提示我们从该角度出发,探索OPLL的发病与miRNA的发病机制、临床诊断和治疗之间的关系。因此,我们设计了相关实验,筛选出OPLL的特异性miRNA,从而为无创、高效的诊断OPLL提供新方法、新途径。第一部分:疾病特异性miRNAs筛选本部分为前期结果,我们利用高通量测序技术筛选出了OPLL中差异表达的miRNAs,确定了5个显著上调的miRNAs(miR-10a-3p,miR-10a-5p,563,885-5p,和210-3p)和5个显著下调的miRNAs(miR-129-3p,199b-5p,212-3p,218-3p和196b-5p)。随后,利用real-time PCR进行了验证,发现了多种miRNAs与OPLL具有较强的相关性,提示差异表达的miRNAs可能和OPLL的发生、发展有关。为后续研究OPLL的特异性生物标志物提供了前期基础和研究OPLL发病机制的切入点。第二部分:外周血miRNA的验证及稳定性检测方法:(1)根据影像学表现及临床症状选取5例健康志愿者,并分别采集外周血;(2)通过qPCR验证上述实验所获取的表达上调最显著的5种miRNA;(3)冻融实验验证血清、血浆中miRNA的稳定性。结果:(1)经外周静脉抽取5例健康志愿者早晨、空腹时外周血2管(一管为EDTA采血管,用于分离血浆;另一管为普通采血管,用于分离血清);(2)血清和血浆中均可以检测出表达上调最显著的5种miRNA(miR-10a-3p,miR-10a-5p,miR-563,miR-210-3p和miR-885-5p),并且血清和血浆中miRNA表达量无显著性差异;(3)miR-563,miR-10a-3p和内参U6经反复冻融之后表达无明显下降,说明其在外界环境中可稳定存在。结论:我们利用qPCR技术证明在正常人群外周血中同样存在多种差异表达的miRNA,它们在血清和血浆中广泛存在,均可用于后续实验;除此之外,冻融实验表明部分miRNA在外界环境可稳定存在,为miRNA成为诊断OPLL特异性生物标记物提供可能性。第三部分:外周血OPLL诊断性miRNA的检测方法:(1)根据影像学表现及临床症状进行分组:OPLL组、颈椎间盘退变(Intervertebral disc degeneration,IDD)组、正常对照组;(2)对所有入选人员采集外周血;(3)real-time PCR分析入选miRNAs表达量;(4)三组人群进行miRNAs差异表达统计学分析;(5)确定诊断OPLL的特异性miRNAs,并进行AUC曲线绘制,确定miRNAs诊断特异性。结果:(1)根据影像学表现及临床症状纳入OPLL患者68人、IDD患者45人;正常对照组53人,三组患者年龄、性别等一般参数无显著性差异;(2)经外周抽取三组患者早晨、空腹时外周血(采用EDTA采血管);(3)MiR-10a-3p、miR-196b-5p和miR-129-2-3p表达量在OPLL组和非OPLL组具有显著性差异,在IDD组和OPLL组无显著性差异;miR-218-1-3p表达量在OPLL组和IDD组具有显著性差异,在OPLL组和正常对照组无显著性差异;miR-10a-5p,miR-563和miR-210-3p表达量在三组中均具有显著性差异。(4)MiR-10a-5p,miR-563和miR-210-3p三种miRNAs联合的AUC为0.950。结论:MiR-10a-5p,miR-563和miR-210-3p在三组患者中表达量均有显著性差异,三种miRNAs联合的AUC为0.950,说明三者联合可作为诊断OPLL的特异性生物标志物。小结后纵韧带骨化症是一种临床工作中常见的脊柱韧带骨化性疾病,为椎体后方后纵韧带骨化,压迫后方脊髓,从而产生较重的神经功能障碍。该病早期可无任何症状或症状较轻,无特异性;后期脊髓严重受压时则会出现行走障碍或大小便失禁等症状。诊断该病的金标准为高分辨率薄层CT,但CT检查具有辐射性。近几十年来,随着循环标志物检测技术的发展和应用,越来越多miRNAs种类得以证实,功能状态相关研究也越来越多。目前已经证实miRNAs异常和肿瘤发生、病毒感染等疾病密切相关,但是其与脊柱相关性疾病的关系尚不明确。针对上述问题,我们创新性的从microRNAs入手,寻找二者之间的联系。利用高通量技术的优势,从后纵韧带细胞中筛选出OPLL差异表达的miRNAs,并通过real-time PCR验证差异表达的miRNAs与高通量测序结果基本一致。随后,在OPLL患者外周血中进一步验证了血清和血浆中均可以检测出表达上调最显著的5种miRNAs(miR-10a-3p,miR-10a-5p,miR-563,miR-210-3p和miR-885-5p),说明miRNAs广泛存在于外周血中,结构稳定,并可被检测到,为miRNAs成为诊断OPLL特异性生物标记物提供可能性。最后,我们对已筛选的10种miRNAs在不同脊柱疾病中进行比较分析,从而界定出OPLL特异性生物标志物:miR-10a-5p,miR-563和miR-210-3p。三种miRNAs联合的ROC曲线分析表明其AUC为0.950,为诊断OPLL提供另一条途径,不仅为诊断OPLL提供了前期理论依据,而且为解释韧带骨化发生发展提供了方向。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R440
【图文】：

差异表达分析,富集

差异表达分析提示，表达明显上调的5个miRNAs为：miR 和 885-5p，表达明显下调的 miRNAs 为：miR-1973, 19212-3p 和 196b-5p的表达差异的 miRNAs，我们无法确定其是否具有明确问题，我们对所得结果进行 GO 分析和 KEGG 富集分析（P <0.01）GO 术语与上调基因相关，其中对骨化形成重骼系统发育、胶原纤维组织和成骨细胞分化；下调的基无关联。在 KEGG 富集分析中，我们发现 TGF-β 信号及钙信号通路高度富集。为进一步证实结果，我们采用ime PCR）对 5 个显著上调的 miRNAs（miR-10a-3p, miR-3p）和 5 个显著下调的 miRNA（smiR-129-3p, 199b-5p, 21行验证，结果显示 10 个 miRNAs 的表达变化趋势与高期实验流程图见图 1-2.

实验流程,外周血,样本,生物标志物

图 1-2 图示前期实验流程图（共分六个步骤）然而，上述实验均为组织层面所得结果。确定疾病的诊断标志物要求样本易获取，方法简单、快速，外周血无疑成为最佳样本获取来源。但外周血内是否同样存在上述已获得的 miRNAs？表达量如何？是否具备作为生物标志物的条件？基于以上猜测和疑问，我们设计了后续实验。

冻融循环,表达水平,变化趋势,血浆

图 2-1 5 种表达上调的 miRNAs 在血清和血浆中表达外周血 miRNA 体外稳定性检测反复冻融实验，每一次冻融循环后均检测血浆中 miRNA 进行对比，结果显示 miR-563、miR-10a-3p 和 U6 表达量稳定，说明 miRNAs 可在体外血浆中稳定存在（见图 2

【参考文献】