骨质疏松患者血细胞沉淀菌群结构分析

发布时间：2020-08-25 11:13

【摘要】：随着超显微技术、二代测序技术以及新的菌培养技术的不断发展,研究人员发现健康人和疾病患者的血液和血细胞内存在一定量的细菌,这些细菌具有休眠和不可培养的特点。采用基于16S rRNA基因测序技术可以有效检测这些休眠菌的存在,并研究血细胞菌群结构与疾病的关系。目前文献已报道一些患有慢性疾病和老年性疾病如:II型糖尿病、心血管疾病、阿尔兹海默症、帕金森等的患者血液中都存在异常的微生物菌群。骨质疏松是老年人常见的一种骨退行性病变,是以骨量降低,骨架构完整性破坏、骨脆性增加为特征的全身性骨病,骨量受年龄、环境、激素水平、营养、免疫等多种因素调节,近年来研究发现肠道菌群是骨量的重要调节因素。由于很多慢性疾病血液样本中含有细菌,因此如果能在骨质疏松患者血液中检测到与骨量相关的菌群,将为研究骨质疏松发病机制以及血细胞菌群对骨量的影响提供新的线索。目的:本实验利用16S rRNA基因测序技术研究骨质疏松患者血细胞沉淀中的菌群结构特点,分析优势菌种与临床指标的关系,确定血液菌群与骨质疏松症具有相关性。方法:1.选取符合临床诊断标准的骨退行性病变伴有骨质疏松患者8例(ST组)、骨退行性病变无骨质疏松患者12例(T组),健康人4例(N组)。收集患者血常规血样以及生物化学、血常规、尿常规等检测报告,用于研究菌群与临床指标相关性分析。2.收集血细胞沉淀,提取总基因组DNA,16S rRNA基因V4区扩增,使用Illumina HiSeq测序。3.生物信息学分析:包括OTU生成,测序数据质控,菌群多样性,骨质疏松患者血细胞沉淀中相对丰度值Top10的菌属和菌种在三组样本中的变化规律以及血细胞沉淀中菌种的相对丰度值与临床指标的相关性。生物信息学分析工具为QIIME分析平台及R相关工具包:pcoa.plot、ggplot、Anova、corrplot、Hmisc等。结果1.24份血细胞沉淀样本中均含有细菌,提示骨退行性疾病患者和健康人血细胞沉淀中都含有细菌。2.血细胞沉淀中检测出的序列总数、注释得到的OTU数目以及注释上OTU的样本序列总数均与血液中性粒细胞数目呈中等程度正相关,提示部分细菌可能来自是中性粒细胞内部,或者是黏贴在粒细胞表面。3.三组样本血细胞沉淀中的菌群多样性分析与比较显示,门分类水平上ST组的菌群结构为:Proteobacteria(变形菌门,42%),Firmicutes(厚壁菌门,28%),Bacteroidetes(拟杆菌门,14%),Actinobacteria(放线菌门,4%),Deinococcus-Thermus(异常球菌数-栖热菌门,3%),Acidobacteria(酸杆菌门,2%),Gemmatimonadetes(单芽胞菌门,2%),Chloroflexi(绿弯菌门,1%),其它菌(4%)。在菌属水平上,ST组菌群多样性有所增加,且均匀度增强,Simpson指数显示三组间的菌群多样性有显著性差异(p=0.0164)。4.骨质疏松患者血细胞沉淀中相对丰度值Top10菌属在三组样本中的变化规律:有4个菌属的相对丰度变化在三组样本间差异显著:Yersinia(耶尔森菌属)和Enterobacter(肠杆菌属)在骨退行性病变尤其是伴有骨质疏松时丰度值偏高(p0.05);但Lachnospiraceae(毛螺菌属)和Prevotellaceae(普雷沃氏菌属)则相反,在骨发生退行性病变尤其是伴有骨质疏松时相对丰度值则变低(p0.05)。5.骨质疏松患者血细胞沉淀中相对丰度值Top10菌种在三组样本中的变化规律:有4个菌种在骨质疏松发生时相对丰度值增高:Yersinia ruckeri、Enterobacter spp.、Rhodanobacter_uncultured_bacterium和Raoultella spp.(p0.05),其余6个菌种相对丰度值在三组样本中无明显差异。6.骨质疏松组的4个变化菌种与24个样本的83个临床指标的相关性分析结果发现Yersinia ruckeri、Rhodanobacter_uncultured_bacterium、Enterobacter spp.和Raoultella spp.与临床多种指标相关。这些指标包括已知的与骨代谢密切相关的因素:血清磷和年龄;以及近几年新发现的与骨量相关的血清学指标:总胆红素、淋巴细胞、血尿酸等。结论:骨质疏松患者血细胞沉淀中菌群结构发生了改变,其中4种细菌与临床多种骨量相关血清学指标相关,提示这些细菌的增多可能与骨质疏松的发生发展有关。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R580;R446.5
【图文】：

退行性病变,骨质疏松,血细胞,患者

大连医科大学硕士学位论文松患者 12 例(T 组)，健康人 4 例(N 组)，按照菌 DNA 提取方法，总DNA。经过 Nanodrop检测，每份样本血细胞沉淀中的 DNA浓度均测序所需的最低浓度标准（图 1A）, 琼脂糖凝胶电泳显示 DNA 1B）。利用细菌的 V4 通用引物对各样本进行 16S rRNA 基因 PCR血细胞沉淀样本中均含有菌 16S rRNA 基因扩增产物（图 2）。

序列,血细胞,PCR扩增,测序

12图 2 24 份血细胞沉淀的 16S rRNAV4 区 PCR 扩增结果PCR 扩增结果显示 24 份样本都存在菌 16S rRNA 基因（M：DNA Marker）测序数据质控分析结果24 份样本经过 v4 可变区域测序后得到的每一条序列，根据指定的相似度，进作，即 OTU 划分，得到每一个样品中的菌种、菌属等数目信息（表 3）。通

曲线,曲线分析,样本,测序

图 3 24 个样本 Shannon-Winner 曲线分析代表一个样品，用不同颜色标记，末端数字为实际测序条数；起初曲线直数远不足覆盖样品导致；数值升高直至平滑说明该实验测序条数足以覆盖大部分微生物。

【参考文献】