基于非酶连接滚环扩增的开关系统对MicroRNA荧光检测方法的研究

发布时间：2020-09-27 14:15

　　 目的:MicroRNA(微小RNA,miRNA)是一类进化上保守的小非编码RNA,参与基因表达的调控并影响多种生物过程,包括细胞分化、免疫反应和肿瘤发展等。近年来,miRNA已被公认为一种监测某些临床疾病的非侵入性生物标志物,例如已发现miRNA-21与miRNA-141在晚期前列腺癌患者中高度升高;血浆中miRNA-451和miRNA-486-5p的含量升高,可以在一定程度上提示胃癌;miRNA-124-5p是肿瘤抑制因子,其可作为胶质瘤诊断的分子标志物。因此,简便、灵敏和特异地检测癌症相关的mi RNA,可以为癌症的早期阶段提供有力的依据。本研究联合点击化学与滚环扩增(NELRCA)策略构建了荧光开关传感系统,该策略可实现对目标物miRNA-21的灵敏检测,检测限低至0.75 fM。同时,这种方法也在未来癌症的即时诊断和个体化治疗中提供一个有意义的生物传感分析平台。方法:1.荧光开关传感系统的制备:基于点击化学非酶连接方法和滚环扩增策略构建一种高灵敏的荧光生物传感器。运用琼脂糖凝胶电泳、原子力显微镜(AFM)、荧光分析技术等方法对本文应用的氧化石墨烯(GO)材料进行表征及对此传感系统的可行性进行验证。2.分析荧光开关传感系统的可行性和实验条件的优化:用琼脂糖凝胶电泳和荧光分析方法验证传感系统的可行性;优化Cu~(2+)和抗坏血酸的浓度比、Phi29 DNA聚合酶、NELRCA反应时间及孵育温度、信号探针与GO的相对浓度比等实验条件。3.传感系统分析性能评价及目标物的分析检测:合理评价设计方法的分析性能,如线性范围、最低检测限、特异性等;将miRNA-21作为目标物样本,其经扩增后的产物RCPs在490nm处被激发下,检测500nm到600nm的荧光信号强度。结果:1.用多种方法对点击化学连接非酶连接和滚环扩增策略构建的荧光开关传感系统进行表征和验证,结果表明合成的修饰型环形模板可成功用于目标物的特异性识别和扩增。2.基于NELRCA策略构建的荧光开关传感系统各项性能:能对低丰度目标物mi RNA-21进行高灵敏检测;检测线性范围在1 fM-1μM;最低检测限为0.75 fM;分析时间可控制在3小时以内;特异性良好;本研究方法与其他miRNA检测方法的分析性能对比,具有较大的优势。结论:本研究应用点击化学连接和滚环扩增策略构建用于miRNA分析的荧光开关传感系统。该传感体系中三唑键修饰型的环形模板(MCT)展现出对目标物mi RNA-21的高灵敏、特异性分析性能。研究中,运用多种技术对合成的MCT和构建的NELRCA传感体系进行表征,证实目标物扩增元件的成功制备。所构建的荧光传感平台采用先杂交后吸附的检测程序显著地简化了目标物的分析过程。更重要的是,通过合理设计不同的MCTs以及具有不同荧光团的多种信号探针,可用于后续研究中多种癌症相关生物标志物的多重检测。此外,本方法与其他检测方法相比也更具有良好的分析性能。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R446.6
【部分图文】：

14图 1 荧光开光系统的制备过程及检测原理Fig. 1 Schematic illustration of this“off-on”switch system based on nonenzymaticligation-rolling circle amplification for fluorescence sensing of miRNA1.2.2 目标物 miRNA 的分析流程在目标物 miRNA 存在的情况下，其能充当引物并启动 NELRCA 反应，合成

图 2 NELRCA 策略的琼脂糖g. 2 Electrophoresis analysis of this nonenzymatRCA) strategy. Lane 1: FLTs; lane 2: MCTs mixPs band was not observed in the presence of nowas observed in presence of t果与分析荧光开关系统的可行性验证 （表征琼脂糖凝胶电泳表征目标物扩增 NELRC

重庆医科大学硕士研究生学位论文其迁移速率比 FLT（泳道 1）略慢。泳道 3 是由加入 Exo I 进一步检验 MCT 是否环化成功，只有 FLT 通过 CuAAC 反应点击连接形成三唑键后，成功环形化的 MCT才耐受 Exo I 的降解。泳道 4 是有非目标物 miRNA-141 的情况下，反应体系未观察到 RCPs 产物。泳道 5 是有目标 miRNA-21 存在的情况下，出现了一条高分子量DNA 产物的模糊条带。由电泳结果证实，使用非连接酶合成的环形模板 MCT 成功地对目标物进行了特异性扩增反应，所提出的 NELRCA 策略为可行。2.2 荧光开关系统的可行性分析原子力显微镜图像如图 3显示，GO 具有单层结构和均匀分散，与参考文献[25,26]一致。

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