上海2家教学医院曲霉菌临床株的遗传多样性及药敏监测研究

发布时间：2020-09-27 14:56

　　研究背景曲霉菌(Aspergillus)是一类广泛分布于自然界的丝状真菌,约300余种,其中大多数曲霉菌种仅无性阶段被描述,属于半知菌;少数菌种如烟曲霉已同时发现并描述无性及有性阶段,被归入子囊菌。曲霉菌常见于湿润的土壤、发霉腐烂的面包、谷类等,其中少数菌种可感染人类导致严重疾病。近年来,由于免疫抑制人群数量的增多,侵袭性曲霉感染的发病率呈上升趋势,尤其是易于累及造血干细胞、实体器官移植后及接受免疫抑制剂治疗的患者,其早期诊断困难,死亡率长期居高不下。烟曲霉是临床最主要的致病曲霉菌种,近年来发现其对唑类药物耐药率不断上升,且非烟曲霉感染引起的侵袭性曲霉菌病也不断增加。值得注意的是,曲霉菌各菌种对抗真菌药物的敏感性有显著不同。目前临床上传统的曲霉菌鉴定模式,不能及时准确的将菌株鉴定至种的水平,这常常制约临床采取恰当的治疗方案。目前我国绝大多数地区,包括上海等医疗中心城市,有关的曲霉菌临床分离菌株的遗传多态性及体外对抗真菌药物敏感性监测等研究工作还很不够,尤其缺乏系统地持续性监测调查。因此,本研究随机选取了上海地区2家三级甲等医科大学附属医院,对分离自深部体液样本的曲霉菌株进行了持续2年的分离、培养及保藏,并应用最新的分子标记技术及药敏监测操作规范,对相关曲霉菌临床分离株的种群遗传多态性以及药物敏感性进行研究,为提高上海乃及我国的曲霉病临床诊治水平提供有价值的参考依据及研究基础。研究目的第一,通过多基因测序及序列分析等分子标记技术对相关曲霉菌株进行分子鉴定及遗传多样性分析,明确相关曲霉菌株的种群构成及种内遗传变异特征;第二,通过体外药敏试验调查相关菌株对现有抗真菌药物敏感性特征,为临床合理用药提供科学参考;第三,对筛选出的曲霉菌耐药烟曲霉菌株,检测其唑类耐药突变位点,初步分析其耐药的演化分子机制。研究方法第一部分对分离自上海地区两家教学医院住院患者的深部体液样本的相关菌株,采用核酸扩增技术分别对ribosomal internal transcribed spacer region(ITS)、β-tubulin和calmodulin三个基因片段进行扩增测序,与NCBI数据库进行BLAST比对后初步鉴定至种水平;分别利用上述三个基因及联用其序列,利用MEGA7.0软件,采用K2+G模型和K2+G+I模型,利用最大似然法构建系统发育树,将每一菌株鉴定至种的水平,并比较ITS,β-tubulin和calmodulin三个单基因片段序列对鉴定曲霉菌属的优劣。第二部分利用最新的肉汤微量稀释法(CLSI M38-A2方案),对相关曲霉菌临床分离株进行9种临床一线抗真菌药物的体外敏感性试验,并筛选出耐药菌株。第三部分将药敏试验中筛选出的对唑类耐药烟曲霉进行cyp51A基因的扩增及测序,与唑类敏感烟曲霉菌株(GenBank accession no.AF338659)进行序列比对,确定其耐药突变位点。结果第一部分本研究中收集的菌株菌种构成包括烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)、聚多曲霉(Aspergillus sydowii)、溜曲霉(Aspergillus tamarii)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)和土曲霉(Aspergillus terreus)共9种曲霉菌,其中以烟曲霉(54.6%;59/108)为主。相关菌株主要分离自呼吸系统标本(90.7%;98/108),且烟曲霉(58.2%;57/98)为呼吸系统的最主要致病曲霉菌;然而在来自非呼吸系统标本的曲霉菌株中,非烟曲霉菌(75%;6/8)多于烟曲霉(25%;2/8)。第二部分在本研究中应用的棘白菌素类、唑类和多烯类等9种抗真菌药物中,棘白菌素类药物对相关曲霉菌菌株的抗菌活性最高(MEC_(50) 0.03μg/ml;MEC_(90)0.25μg/ml),其次为唑类(MIC_(50) 0.5μg/ml;MIC_(90) 2μg/ml)及多烯类(MIC_(50) 1μg/ml;MIC_(90)2μg/ml)。其中棘白菌素类药物中以阿尼芬净的敏感性最高(MEC_(50) 0.03μg/ml;MEC_(90)0.03μg/ml);唑类药物中以泊沙康唑的敏感性最高(MIC_(50) 0.25μg/ml;MIC_(90) 0.5μg/ml)。另外,我们发现相当比例的菌株(34.3%的MIC值≥2μg/ml)对两性霉素B敏感性下降,值得警惕及后续相关研究进一步监测。第三部分本次研究中发现烟曲霉的唑类耐药率约6.8%,且首次在上海地区发现存在TR46/Y121F/T289A突变位点的烟曲霉菌株;同时,我们还发现了2株对唑类耐药的烟曲霉菌株同时存在F46Y,G89G,M172V,N248T,D255E的突变位点。结论本研究中收集自2所教学医院的曲霉菌临床分离菌株种类主要包括烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、塔宾曲霉、聚多曲霉、溜曲霉、构巢曲霉和土曲霉这8个菌种,烟曲霉仍是优势致病曲霉菌种。体外抗真菌药敏试验提示,棘白菌素类药物对本次研究收集的曲霉菌株的抗菌活性最高,其次为唑类、多烯类。烟曲霉菌株对唑类耐药率有所上升,且相关耐药突变位点存在丰富的多样性,且首次在上海地区发现含TR46/Y121F/T289A突变位点的交叉耐药烟曲霉菌株,提示相关耐药菌株存在多种起源及演化途径,值得真菌病学、医学真菌学及流行病学等领域的学者警惕,未来在上海地区就烟曲霉临床与环境分离菌株对唑类药物的耐药趋势进行系统的、长期的监测研究对于临床侵袭性曲霉病的诊治是非常必要的。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R446.5
【部分图文】：

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图 2. ITS、BenA、CaM 基因峰值图（五）分子鉴定结果在 NCBI 官方网站中的核酸 BLAST 中，将上述所有 ITS、BenA、CaM 基因的扩增产物序列与 Genbank 数据库中的标准菌株进行比对分析后结果显示：ITS 序列将曲霉菌分类到物种复合体水平，包含烟曲霉属 59 株(54.6%)，黄曲霉属 25 株(23.2%)，黑曲霉属 20 株(18.5%)，杂色曲霉属 2 株(A.versicolor complex; 1.9%)，土曲霉属 1 株(0.9%)，构巢曲霉 1 株(0.9%)；除上述常见菌种以外，BenA 基因还鉴定出少见物种株(8.3%)，其中以塔宾曲霉(A. tubingensis; 5.5%, 6/108)为主，其次为聚多曲霉(A.sydowii; 1.9%, 2/108)，溜曲霉(A. tamarii; 0.9%, 1/108)；由 CaM 基因鉴定的少见物种有18株(16.7%)，其中以塔宾曲霉(5.5%, 6/108)为主；其次为新爱耳曲霉(A. neoelliptic3.7%, 4/108)，泡盛曲霉(A. awamori; 2.8%, 3/108)，聚多曲霉(1.9%, 2/108)，A.effusu(1.9%, 2/108)，溜曲霉(0.9%, 1/108)。具体结果请见表 1、表 2。

系统进化树,曲霉菌,基因序列

曲霉菌ITS基因序列的系统进化树(续下)

曲霉菌,系统进化树,遗传多样性,上海

曲霉菌ITS基因序列的系统进化树(续上)

【参考文献】