膀胱癌特异性的嵌合型溶瘤腺病毒构建及其疗效初步评价

发布时间：2017-04-14 18:16

  本文关键词：膀胱癌特异性的嵌合型溶瘤腺病毒构建及其疗效初步评价，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的对于恶性度高的膀胱癌细胞,其表面的柯萨奇-腺病毒受体(coxsackie adenovirus receptor,CAR)表达极低,5型腺病毒有限的转导效率难以发挥溶瘤效果。我们课题组通过基因改造变换病毒的亲嗜性,即选用11型腺病毒纤毛结合5型腺病毒骨架,并将膀胱组织特异性启动子尿路空斑蛋白2(uroplakin II,UPII)和前列腺干细胞抗原增强子(prostate stem cell antigen enhancer,PSCAE)的基序插入病毒复制早期基因E1A前,构建具有膀胱癌选择性的不依赖于CAR的嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/F11-PSCAE-UPII-E1A。观察嵌合型腺病毒对EJ和T24两种膀胱癌细胞株的形态、增殖能力的影响,探求病毒的最适感染剂量,进一步对比观察嵌合型腺病毒Ad/F11-PSCAE-UPII-E1A和5型腺病毒Ad5-PSCAE-UPII-E1A对EJ和T24细胞转导效率和溶瘤能力的差异,为膀胱癌基因治疗提供新的选择和实验依据。方法将嵌合11型纤毛的5型腺病毒骨架Ad5/F11,与本室保存的穿梭质粒Rp-PSACE-UPII-E1A,在大肠杆菌BJ5183内将同源区段替换重组。在卡那霉素抗性条件下,筛选出阳性单克隆重组子菌落,抽提质粒后PCR扩增UPII、PSCAE和E1A基因,并用PacI和BsrGI酶切质粒,电泳检测产物大小。挑取鉴定完全正确的重组腺病毒质粒,纯化后设不同比例转染HEK293细胞,观察病毒包装结果。提取第一代腺病毒基因组,经PCR检测各目的基因的正确性,然后以第一代病毒感染HEK293细胞大量扩增,纯化病毒后采用TCID50法测定滴度。常规培养EJ和T24细胞,以HEK293为标准,RT-PCR检测两种细胞表面CD46的相对表达量。CCK8测定嵌合型腺病毒Ad5/F11-PSCAE-UPII-E1A在不同梯度的感染复数(multiplicity of infection,MOI)下,对EJ细胞和T24细胞的溶瘤能力,取病毒感染最佳MOI,与5型腺病毒Ad5-PSCAE-UPII-E1A作比较,病毒干预8d后,测定EJ和T24两种细胞的活力变化。结果腺病毒Ad5/F11-PSCAE-UPII-E1A构建成功,滴度为1×1010PFU/ml。RT-PCR数据显示EJ和T24细胞的CD46表达明显高于HEK293细胞。CCK8测定结果表明,以20~40 MOI病毒量干预EJ和T24细胞后,细胞存活率的下降速度最快。与Ad5-PSCAE-UPII-E1A相比,Ad5/F11-PSCAE-UPII-E1A对EJ和T24细胞的溶瘤作用较为显著。感染8d后,Ad5/F11-PSCAE-UPII-E1A病毒干预组EJ和T24细胞的存活率分别为19.6±3.48%和51.8±2.48%;Ad5-PSCAE-UPII-E1A病毒干预组EJ和T24细胞的存活率分别为33.38±2.54%和80.27±2.18%。结论膀胱选择性的高滴度腺病毒Ad5/F11-PSCAE-UPII-E1A构建成功,能高效杀伤T24和EJ细胞,溶瘤能力优于腺病毒Ad5-PSCAE-UPII-E1A,这与病毒识别受体的改变有关,提示增加病毒的转导效率可直接强化病毒溶瘤效果,这为膀胱癌治疗的选择奠定初步的实验基础。
【关键词】：膀胱癌 基因治疗 尿路空斑蛋白 前列腺干细胞抗原 溶瘤腺病毒 嵌合型
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.14;R450
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 缩略词表7-10
• 一 前言10-16
• 二 材料与方法16-27
• 2.1 实验材料与试剂16-17
• 2.1.1 质粒、细菌菌株和细胞株16
• 2.1.2 主要实验试剂16
• 2.1.3 主要溶液配制16-17
• 2.1.4 主要仪器与设备17
• 2.2 实验方法17-27
• 2.2.1 细胞复苏、培养与冻存17-18
• 2.2.2 引物设计和合成18
• 2.2.3 感受态细菌的制备18-19
• 2.2.4 重组质粒的提取与鉴定19-20
• 2.2.5 腺病毒载体的构建20-22
• 2.2.6 腺病毒的包装、扩增及纯化22-24
• 2.2.7 TCID50法测定病毒滴度24
• 2.2.8 RT-PCR检测EJ和T24的CD46表达24-26
• 2.2.9 重组腺病毒对EJ和T24感染效率的测定26
• 2.2.10 重组腺病毒对EJ和T24细胞作用的比较26
• 2.2.11 统计学分析26-27
• 三 结果27-34
• 3.1 重组质粒的鉴定27-29
• 3.2 病毒的包装、鉴定及滴度测定29-31
• 3.3 RT-PCR检测CD46的表达31
• 3.4 腺病毒体外抗增殖效应31-34
• 四 讨论34-37
• 五 结论37-38
• 参考文献38-43
• 综述：口颊黏膜在尿道重建中的应用43-49
• 参考文献47-49
• 在学期间的研究成果49-50
• 致谢50

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